镉(Cd)是一种有毒的非必需金属,对人类和动物的健康均构成风险。肾脏是镉积累的主要靶器官,肾小管是镉致肾毒性的主要靶部位。细胞焦亡和衰老均与非病原性(无菌)炎症反应密切相关,但镉致肾损伤过程中细胞焦亡和衰老的发生机制尚不明确。因此,本研究以大鼠肾小管上皮细胞为研究模型,结合体内实验,旨在探讨镉诱导大鼠肾Schmidtea mediterranea脏细胞焦亡和衰老的作用机制。此外,通过建立大鼠肾皮质部Sirtuin-1(SIRT1)过表达模型,进一步探讨SIRT1在其中发挥的作用。主要研究内容如下:1.镉暴露对大鼠肾小管上皮细胞焦亡的影响本试验选用NRK-52E和rPT细胞为研究模型,用CCK8法检测氯化镉对细胞增殖活力的影响;用扫描电子显微镜观察氯化镉处理细胞后细胞的形态学变化;用Western Blot结合qRT-PCR实验检测氯化镉对细胞焦亡相关蛋白和基因表达水平的影响;用ELISA法检测氯化镉对细胞炎性因子释放水平的影响;用分光光度法检测氯化镉对细胞乳酸脱氢酶释放水平的影响。此外,为进一步探究NLRP3炎症小体在镉致细胞焦亡中的作用,用NLRP3 siRNA沉默细胞中NLRP3的表达,用Western Blot结合qRT-PCR实验检测抑制NLRP3蛋白表达或活性对细胞焦亡相关蛋白和基因表达水平的影响;用分光光度法检测抑制NLRP3蛋白表达或活性对细胞乳酸脱氢酶释放水平的影响。结果表明,随着镉浓度的增加,细胞增殖活力显著降低(P<0.05或P<0.01),细胞立体结构坍塌,细胞膜完整性丧失,形成可释放炎性内容物大小的孔洞;与对照组相比,镉暴露组焦亡相关因子(NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD和GSDME)蛋白和基因表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01);乳酸脱氢酶释放水平显著升高(P<0.05或P<0.01),促炎因子IL-6、IL-18、IL-1β和TNF-α的分泌水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。当抑制NLRP3蛋白表达或活性后,焦亡相关因子蛋白和基因表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01),乳酸脱氢酶释放水平也明显被抑制(P<0.05或P<0.01)。上述结果表明,镉在大鼠肾小管上皮细胞中诱导NLRP3依赖性细胞焦亡。2.镉暴露对大鼠肾小管上皮细胞衰老的影响选用NRK-52E细胞为研究模型,氯化镉处理不同时间后,统计β-半乳糖苷酶阳性区域面积;用流式细胞术检测细胞内活性氧含量和线粒体活性氧含量;用Western Blot结合qRT-PCR实验检测NRK-52E细胞衰老和线粒体功能相关指标。结果表明,与对照组相比,随着镉暴露时间延长,细胞衰老标志物β-半乳糖苷酶阳性区域面积显著增加并呈现时间依赖性;镉暴露组衰老相关分泌表型(IL-1β、L-6、和TNF-α)的基因表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01);衰老相关蛋白P53和P21的表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01);细胞内活性氧含量和线粒体活性氧含量显著升高(P<0.05或P<0.01);线粒体功能相关基因(UCP2、COXIV、ATP5α、TFAM和NRF1)的表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01);PGC-1α和PGC-MG1321β蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。同时,镉暴露显著抑制SIRT1的活性(P<0.05或P<0.01)。上述结果表明,镉能加速大鼠肾小管上皮细胞的衰老进程。3.镉暴露对大鼠肾脏损伤及细胞焦亡和细胞衰老的影响以SD大鼠为试验动物进行体内试验,通过自由饮用50mg/L或75mg/L CdCl2水溶液进行镉暴露,在4周、12周、24周和48周试验结束后,分别采集血液和肾脏组织,按照后续试验需求保存样品。检测肾形态学变化和肾功能等肾损伤相关指标;用qRT-PCR和Western blotEmpagliflozin等方法检测焦亡、早衰和线粒体功能相关指标;用Masson染色和免疫组织化学检测大鼠肾纤维化相关指标。结果表明,4周、12周、24周和48周的染毒组大鼠SIRT1蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01),NF-κB活性和焦亡相关蛋白表达显著升高(P<0.05或P<0.01);染毒组大鼠衰老相关蛋白(P53和P21)的表达量显著提高(P<0.05);衰老相关分泌表型的基因表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01);PGC-1α和PGC-1β蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01);Masson染色显示镉暴露组大鼠肾脏纤维化和胶原沉积明显增加;TGF-β、Collagen I和α-SMA免疫染色区域明显增加;α-SMA,Collagen I,MMP2和TGF-β的基因转录水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。上述研究表明,镉暴露诱导细胞发生焦亡和衰老,SIRT1/ac-RelA/p65激活可能参与调节焦亡的发生。4.NAC对镉致大鼠肾脏损伤、细胞焦亡和细胞衰老的影响在体内和体外试验中利用抗氧化剂NAC干预镉诱导的大鼠肾小管上皮细胞焦亡和衰老的过程。用流式细胞术检测NAC对镉处理细胞内活性氧含量和细胞周期分布的影响;qRT-PCR和Western blot检测NAC对焦亡、早衰和肾纤维化相关指标表达水平的影响;分光光度法检测NAC对镉处理细胞乳酸脱氢酶释放水平的影响;Masson染色和免疫组织化学检测NAC对大鼠肾纤维化相关指标的影响。此外,用SIRT1激活剂和抑制剂处理细胞,Western blot检测磷酸化和乙酰化NF-κB在细胞中的表达水平。结果表明,在体内和体外实验中,与镉暴露组相比,NAC显著降低焦亡蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01),抑制乳酸脱氢酶释放水平增加(P<0.05或P<0.01);NAC显著下调p53和p21蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01),降低衰老分泌表型基因表达水平(P<0.05或P<0.01),抑制β-半乳糖苷酶活性,缓解细胞周期阻滞;NAC显著下调线粒体生发蛋白PGC-1α和PGC-1β表达水平(P<0.05或P<0.01),降低线粒体功能相关基因水平(P<0.05或P<0.01);NAC缓解肾脏纤维化和胶原沉积,减少TGF-β、Collagen I和α-SMA阳性区域。此外,SIRT1激活剂显著降低了磷酸化和乙酰化NF-κB蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01)。上述研究表明,NAC能够显著减轻镉诱导的细胞氧化应激和肾损伤,延缓氧化应激诱导大鼠肾小管上皮细胞焦亡与衰老的发生,SIRT1/NF-κB轴在其中发挥重要作用。5.SIRT1在镉致肾细胞焦亡和衰老中的作用在体内试验中建立大鼠肾脏SIRT1过表达模型,在体外试验中使用SIRT1激活剂和抑制剂处理细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测焦亡、早衰和肾纤维化相关指标表达水平的影响;分光光度法检测细胞乳酸脱氢酶释放水平的影响;透射电镜观察细胞线粒体形态结构变化;Masson染色和免疫组织化学检测大鼠肾纤维化相关指标的影响。结果表明,在体内和体外实验中,与镉暴露组相比,SIRT1过表达显著降低焦亡蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01),抑制乳酸脱氢酶释放水平增加(P<0.05或P<0.01);SIRT1过表达显著下调p53和p21蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01),降低SASP因子基因转录水平(P<0.05或P<0.01),抑制β-半乳糖苷酶活性,缓解细胞周期阻滞;SIRT1过表达显著下调PGC-1α和PGC-1β表达水平(P<0.05或P<0.01),降低线粒体功能相关基因表达水平(P<0.05或P<0.01);SIRT1过表达缓解肾脏纤维化和胶原沉积,减少TGF-β、Collagen I和α-SMA阳性区域。上述结果表明,通过过表达SIRT1抑制焦亡能显著降低镉诱导的衰老细胞的积累和肾组织纤维化。综上所述,镉能引起大鼠肾脏氧化应激,从而导致肾损伤、肾细胞发生焦亡、肾过早衰老和肾纤维化;SIRT1去乙酰化NF-κB(RelA/p65)调控镉诱导的大鼠肾小管上皮细胞焦亡;过表达SIRT1抑制焦亡能显著降低镉诱导的大鼠肾小管上皮细胞衰老和肾纤维化。