子宫内膜癌是immunostimulant OK-432女性生殖道常见的三大恶性肿瘤之一,也是女性中第六大常见癌症。近年来,其发病率在全球范围内不断上升,严重威胁女性的身心健康。子宫内膜癌发病的高危因素包括肥胖、人口老龄化、种族差异、内源性或外源性雌激素暴露、初潮早、绝经晚、代谢综合征(包括糖尿病和多囊卵巢综合征)以及遗传易感性等因素。传统观念将子宫内膜癌分为Ⅰ型和Ⅱ型,即雌激素依赖型和非雌激素依赖型。其中Ⅰ型约占子宫内膜癌的90%,通常与雌激素相关,预后较好。Ⅱ型约占子宫内膜癌的10%,通常为高级别肿瘤,预后较差。由于子宫内膜癌是一种异质性疾病,传统分型在诊断的可重复性和预测预后等方面存在局限性。为了精确诊断和精准治疗,基于基因组学的TCGA分型将子宫内膜癌分为POLE超突变型、微卫星不稳定型(MSI)、低拷贝型(CN-L)和高拷贝型(CN-H)4个分子亚型。其中预后最好的是POLE超突变型,其次是MSI型和CN-L型,最差的是CN-H型。TCGA分型对于指导治疗方式的选择及预测子宫内膜癌患者的预后情况具有重要的意义,更加精细化的分型对子宫内膜癌的诊治将会有更重要的临床意义。因此,探究子宫内膜癌发生发展的机制,对于改善早期诊断、治疗和预后情况至关重要。蛋白质二硫键异构酶家族 A 成员 6(Protein disulfide isomerase family A member 6,PDIA6)是PDI家族的一员,位于人2号染色体短臂2区5带,又称为ERp5,P5或TXNDC7。大量的研究证据表明,PDIA6在多种肿瘤的发生发展过程中发挥着异常重要的作用。而且,在不同的肿瘤中,PDIA6扮演的角色具有两面性。例如,PDIA6在非小细胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤中表达上调,并促进这些肿瘤的发生发展,且与其不良预后密切相关。相反,PDIA6在胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭中起到抑制作用。然而,PDIA6在子宫内膜癌中的生物学作用及分子机制尚未阐明。因此,本课题旨在分析PDIA6在子宫内膜癌中的表达情况,进一步探究PDIA6对子宫内膜癌恶性生物学行为发挥的作用和可能机制,以期为子宫内膜癌的治疗提供一种新思路,从而进一步改善子宫内膜癌患者的预后。本课题的主要研究内容包括以下三部分。第一部分:PDIA6在子宫内膜癌中的表达及其临床意义的研究研究目的探讨PDIA6在子宫内膜癌组织和细胞中的表达情况及其与临床病理特征之间的关系。研究方法使用生物信息学方法分析GEO数据库中的基因表达谱芯片数据集(GSE17025)、TCGA数据库和CPTAC数据库中PDIA6 mRNA和蛋白质在正常子宫内膜组织以及子宫内膜Wnt-C59癌组织中表达水平的差异。通过实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、Western Blot 实验检测 PDIA6 在正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织中的表达情况。通过免疫组化实验分析PDIA6在子宫内膜癌中的表达水平,同时分析PDIA6与子宫内膜癌患者临床病理特征之间的关系;使用Kaplan-Meier法分析PDIA6与子宫内膜癌患者总体生存期(Overall survival,OS)和无复发生存率(Recurrence Free Survival,RFS)之间的关系。研究结果1.与正常的子宫内膜组织相比,PDIA6在子宫内膜癌组织中的表达呈升高趋势,差异具有统计学意义(p<0.05)。2.与正常的子宫内膜基质细胞HESC相比,PDIA6在子宫内膜癌细胞系(Ishikawa、AN3CA、HEC-1A、RL-95)中呈相对高表达趋势,差异具有统计学意义(p<0.05)。3.子宫内膜癌高表达PDIA6和子宫内膜癌患者的FIGO分期、淋巴结转移呈显著正相关(p<0.05),与患者的年龄、是否绝经、分化程度以及肿瘤的大小等没有显著相关性。4.在子宫内膜癌患者中,PDIA6高表达患者的RFS较低表达患者更短,差异具有统计学意义(p<0.05)。研究结论PDIA6在子宫内膜癌中高表达。PDIA6的高表达与子宫内膜癌的FIGO分期、淋巴结转移以及更低的RFS密切相关,可以作为判断子宫内膜癌预后的指标。第二部:PDIA6对子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的影响及机制研究研究目的探究PDIA6对子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭功能的影响及作用机制。研究方法通过转染小干扰和慢病毒,构建PDIA6下调或上调的子宫内膜癌细胞系。利用CCK-8、克隆形成实验和Edu实验检测PDIA6对子宫内膜癌细胞体外增殖能力的影响;通过裸鼠皮下成瘤实验验证PDIA6对子宫内膜癌细胞体内增殖能力的影响。利用Transwell和划痕实验检测PDIA6对子宫内膜癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响。利用转录组基因测序技术分析发现,在子宫内膜癌细胞中敲低PDIA6的表达后可引起了TGF-β信号通路的变化,通过Western blot检测敲低和过表达PDIA6后TGF-β信号通路相关蛋白的表达情况,探究PDIA6影响子宫内膜癌恶性生物学行为的可能机制。研究结果1.下调PDIA6的表达可导致子宫内膜癌细胞的增殖能力减弱,而过表达PDIA6子宫内膜癌细胞的增殖能力增强。裸鼠皮下成瘤实验证明,下调PDIA6后子宫内膜癌细胞的成瘤能力明显下降,而过表达PDIA6后子宫内膜癌细胞的成瘤能力明显增强,差异具有统计学意义(p<0.05)。2.下调PDIA6的表达后,子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭能力明显减弱,而过表达PDIA6后,子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭能力明显增强,差异具有统计学意义(p<0.05)。3.Western blot的结果显示,下调PDIA6后,上皮性标志物E-cBAY 73-4506 IC50adherin的表达量增多,而间质性标志物N-cadherin的表达量减少,c-MYC的表达量减少;上调PDIA6后,E-cadherin的表达量减少,而N-cadherin和c-MYC的表达量增多。4.PDIA6与TGF-β信号通路显著相关,下调PDIA6后可影响TGFBR1,Smad2和Smad3磷酸化水平的表达。研究结论1.PDIA6可以促进子宫内膜癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化。2.PDIA6可以通过激活TGF-β信号通路影响子宫内膜癌的恶性生物学行为。第三部分:PDIA6上游调控机制研究研究目的探究PDIA6在子宫内膜癌中的上游调控机制。研究方法通过 MiRanda:http://www.miranda.org/,miRmap:https://mirmap.ezlab.org/,PicTar:https://pictar.mdc-berlin.de/和 Targetscan7.2:https://www.targetscan.org/vert_72/多个数据库取交集,预测可能与PDIA6结合的miRNA及其结合位点,再与TCGA数据库和GSE25405数据集中均上调的miRNA取交集,以确定可能调控PDIA6表达的miRNA。通过 qRT-PCR 检测转染 miR-424-5p 模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor)后子宫内膜癌细胞系中PDIA6的表达情况。通过双荧光素酶试验验证miR-424-5p与PDIA6之间存在直接结合的关系。进一步通过在线网站 Starbase:https://starbase.sysu.edu.cn/,TCGA数据库预测可能与miR-424-5p结合的长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)。通过 qRT-PCR检测敲低或过表达 TRPM2-AS后miR-424-5p的表达变化。通过双荧光素酶试验和RIP实验验证TRPM2-AS与miR-424-5p之间存在直接结合的关系。通过qRT-PCR实验检测TRPM2-AS在正常的子宫内膜组织和子宫内膜癌组织中的表达差异。利用转染小干扰和慢病毒,构建TRPM2-AS下调或上调的子宫内膜癌细胞系。通过CCK-8和克隆形成实验探究TRPM2-AS对Ishikawa和AN3CA细胞体外增殖能力的影响;通过裸鼠皮下成瘤实验探究TRPM2-AS对Ishikawa和AN3CA细胞体内增殖能力的影响。通过Transwell和划痕实验检测TRPM2-AS对子宫内膜癌细胞系迁移、侵袭能力的影响。通过Western blot检测敲低和过表达TRPM2-AS后E-cadherin、N-cadherin、c-MYC的表达变化。对GEO数据集(GSE40687)的差异基因进行KEGG富集分析发现,TRPM2-AS与TGF-β信号通路的具有相关性。最后,通过体外的挽救实验证明PDIA6受到TRPM2-AS/miR-424-5p的调控,从而促进子宫内膜癌细胞的恶性生物学行为。研究结果1.PDIA6促进子宫内膜癌细胞的恶性生物学行为受miR-424-5p的直接靶向调控。2.miR-424-5p是TRPM2-AS的直接靶点,并被TRPM2-AS负调控。3.与正常的子宫内膜组织相比,TRPM2-AS在子宫内膜癌中呈高表达趋势,下调TRPM2-AS可导致子宫内膜癌细胞增殖功能减弱,而过表达TRPM2-AS结果相反。裸鼠皮下成瘤实验证明,下调TRPM2-AS后子宫内膜癌细胞的皮下成瘤能力受到了抑制,过表达TRPM2-AS后其皮下成瘤能力明显增强,差异具有统计学意义(p<0.05)。4.下调TRPM2-AS的表达,子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭功能明显减弱;而过表达TRPM2-AS可增强子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭功能,差异具有统计学意义(p<0.05)。5.Western blot的实验结果显示,下调TRPM2-AS后,上皮性标志物E-cadherin的表达量增多,而间质性标志物N-cadherin的表达量减少,c-MYC表达量减少;过表达TRPM2-AS后,上皮性标志物E-cadherin的表达量明显减少,而间质性标志物N-cadherin的表达量增多,c-MYC表达量增多。研究结论PDIA6在子宫内膜癌进展过程中的促进作用受TRPM2-AS/miR-424-5p轴的调控。