研究背景及目的:癌症是全球范围的重大健康问题,严重威胁人类的生命安全。由于肿瘤起病隐匿,多数患者在诊断时已是晚期,失去手术根治的机会。尽管在癌症诊断及治疗手段方面取得了一定的发展,靶向治疗及免疫治疗的出现很大程度提高了癌症的疗效,显著延长了患者的生存期,但是有效率低、原发或继发性耐药等问题仍亟须解决。深入阐明肿瘤发生发展机制、探索新的治疗靶点,有助于改善癌症治疗的效果、延长生存期。TP53作为突变频率最高的抑癌基因,可通过多种机制参与肿瘤细胞的凋亡、细胞周期阻滞、DNA修复、代谢重塑等过程。CircRNA为广泛存在于各种类型肿瘤中的一类环状非编码RNA,与肿瘤的发生发展密切相关。有研究表明,circRNA可通过调控p53的水平及定位,或通过影响p53下游靶基因发挥抑癌或促癌作用。目前为止,少有研究报道circRNA作为p53的直接靶点发挥其功能。本研究拟通过RNA表达谱芯片分析筛选出受p53调控的circRNA,并深入探究其功能及分子机制。研究方法:1.通过化疗药物和p53激动剂处理携带野生型p53的肿瘤细胞,随后进行RNA表达谱芯片分析筛选表达水平受p53调控的circRNA;2.通过sanger测序及反向引物PCR验证circFRMD4A的环状结构;3.通过RNase R酶及act D处理细胞后qPCR检测circFRMD4A的稳定性;4.核质分离实验检测circFRMD4A的亚细胞定位;5.在不同p53状态的细胞系中激活或干扰p53的表达后,qPCR检测circFRMD4A的表达,验证p53对circFRMD4A的调控作用;6.The p53MH algorithm预测p53与circFRMD4A母本基因FRMD4A启动子区的结合位点,并通过染色质免疫共沉淀实验验证其结合;7.荧光素酶报告基因实验验证p53对FRMD4A的转录激活作用;8.在线网站RBPsuite和RBPmap预测与组成circFRMD4A的外显子两端侧翼内含子相互结合的RNA结合蛋白(RBP),并通过siRNA敲低RBPs后检测circFRMD4A的表达水平,筛选促进circFRMD4A环化的RNA结合蛋白;9.通过RNA免疫共沉淀实验进一步证实EWSR1与组成circFRMD4A的外显子两端侧翼内含子结合;10.通过CCK-8增殖实验、克隆形成、transwell、流式细胞术检测过表达或干扰circFRMD4A对肠癌及乳腺癌细胞生物学行为的影响;11.通过慢病毒感染HCT116细胞构建稳定过表达或敲低circFRMD4A的细胞株,皮下注射构建裸鼠移植瘤模型,观察移植瘤的生长情况;12.药物敏感实验检测p53及circFRMD4A对肠癌及乳腺癌细胞对铜离子载体伊利司莫的敏感性的影响;13.Western blot检测p53及circFRMD4A对铜死亡关键调节因子和标志蛋白FDX1的影响;14.通过RNA pull down实验联合蛋白质质谱分析筛选circFRMD4A的相互作用蛋白;15.RIP实验验证circFRMD4A与PKM2的相互结合,并通过western blot检测p53及circFRMD4A对PKM2表达水平的影响;16.通过检测乳酸及柠檬酸水平评估circFRMD4A对糖酵解及三羧酸循环的影响;17.通过药物联合实验探索p53激动剂APG-115与铜死亡诱导剂Elesclomol联合抗肿瘤效果。研究结果:(一)CircFRMD4A的筛选及其生物学特征的鉴定1.通过化疗药物和p53激动剂处理携带野生型p53的CAL51细胞,提取总RNA后通过RNA表达谱芯片分析得到一组差异表达的circRNA,并通过qPCR在多株细胞中验证,从中筛选出可能atypical infection受p53调控的环状RNA circFRMD4A;2.CircFRMD4A是由FRMD4A基因的第16号至第selleck激酶抑制剂21号外显子通过反向剪接形成的circRNA;3.CircFRMD4A相较线性的母本基因FRMD4A,具有稳定性更高、抵抗RNase R酶消化等特征;4.CircFRMD4A主要定位于细胞质。(二)p53通过对FRMD4A的转录激活作用上调circFRMD4A的表达1.在携带野生型p53的肿瘤细胞中,p53激动剂Nutlin-3、化疗药物顺铂(DDP)及5-氟尿嘧啶(5-FU)可上调circFRMD4A的表达;2.在p53突变或缺失的肿瘤细胞中,Nutlin-3、DDP及5-FU对circFRMD4A的表达无明Enasidenib显影响;3.敲低p53可抑制Nutlin-3、DDP及5-FU对circFRMD4A的上调作用;4.p53与circFRMD4A的母本基因FRMD4A的启动子结合,并对其有转录激活作用;5.RNA结合蛋白EWSR1与组成circFRMD4A的外显子两端的侧翼内含子序列结合并促进其环化;6.EWSR1不影响肠癌及乳腺癌的预后,且敲低EWSR1不影响HCT116和CAL51细胞的增殖;然而,在p53激活状态下,敲低EWSR1促进HCT116和CAL51细胞的增殖。(三)CircFRMD4A在肠癌及乳腺癌中发挥抑癌作用1.过表达circFRMD4A抑制肠癌及乳腺癌细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力,并促进细胞凋亡;2.干扰circFRMD4A促进肠癌及乳腺癌细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力,并抑制细胞凋亡;3.过表达circFRMD4A增强肠癌及乳腺癌细胞对伊利司莫的敏感性;4.干扰circFRMD4A抑制肠癌及乳腺癌细胞对伊利司莫的敏感性;5.过表达circFRMD4A抑制铜死亡关键调节因子和标志蛋白FDX1的表达;6.干扰circFRMD4A促进FDX1的表达;7.激活p53增强肠癌及乳腺癌细胞对伊利司莫的敏感性,干扰circFRMD4A能够逆转p53激活对伊利司莫敏感性的增强作用;8.干扰p53抑制肠癌及乳腺癌细胞对伊利司莫的敏感性,过表达circFRMD4A能够逆转干扰p53对伊利司莫敏感性的抑制作用;9.激活p53抑制FDX1的表达,干扰circFRMD4A能够逆转p53激活对FDX1的抑制作用;10.干扰p53促进FDX1的表达,过表达circFRMD4A能够逆转干扰p53对FDX1的促进作用;11.过表达circFRMD4A抑制裸鼠移植瘤的生长,干扰circFRMD4A促进裸鼠移植瘤的生长。(四)p53通过circFRMD4A调控糖酵解及三羧酸循环1.RNA pull down实验联合蛋白质质谱分析显示,circFRMD4A与丙酮酸代谢相关;2.CircFRMD4A与丙酮酸激酶PKM2相互结合并抑制其表达;3.激活p53抑制PKM2的表达,干扰circFRMD4A能够逆转p53激活对PKM2的抑制作用;4.敲低p53促进PKM2的表达,过表达circFRMD4A能够逆转干扰p53对PKM2的促进作用;5.过表达circFRMD4A抑制肠癌及乳腺癌细胞乳酸的产生,干扰circFRMD4A促进肠癌及乳腺癌细胞乳酸的产生;6.过表达circFRMD4A促进肠癌及乳腺癌细胞柠檬酸的产生,干扰circFRMD4A抑制肠癌及乳腺癌细胞柠檬酸的产生;7.p53激动剂APG-115与铜死亡诱导剂Elesclomol协同抑制肠癌及乳腺癌细胞增殖。研究结论:1.CircFRMD4A由FRMD4A基因的第16至第21号外显子通过反向剪接形成,具有高稳定性及抵抗RNase R酶消化等特点;2.p53通过对FRMDA基因的转录激活作用从而上调circFRMD4A的表达;3.RNA结合蛋白EWSR1促进circFRMD4A的环化;4.CircFRMD4A在肠癌及乳腺癌中发挥抑癌作用;5.p53通过circFRMD4A促进肠癌及乳腺癌细胞的铜死亡;6.p53通过调控circFRMD4A抑制PKM2的表达,从而抑制糖酵解并增强线粒体代谢,最终促进细胞铜死亡;7.p53激动剂APG-115与铜死亡诱导剂Elesclomol具有协同抗肿瘤作用。