苹果产业是我国农业的支柱产业,培育和发展高类黄酮(红肉)苹果等特色多样化品种,对于推动我国苹果产业的优质高效发展、助力健康中国具有重要意义。但由于其自身的遗传特性,果肉中积累花青苷的同时也会促进苹果酸的累积,导致红肉苹果果实酸度一般高于白肉品种。因此,提高果实含糖量是改善高类黄酮苹果鲜食(风味)品质的关键,明确果实糖合成和转运机理是高类黄酮苹果育种的重要基础。SWEET糖转运蛋白是新发现的一类具有糖转运功能的蛋白家族。近年来,人们对其功能展开了一系列研究,指出它在果实糖积累过程中具有重要作用。但人们对它的功能研究大多集中在番茄、黄瓜等作物上,而对于多年生果树研究较少,其在苹果中的功能还不是很清楚。进一步挖掘SWEET糖转运蛋白在果实糖积累过程中的功能,解析其在红肉苹果后代中调控果实糖积累的机理意义重大。本研究以高糖品种‘嘎啦’×高类黄酮苹果种质‘CSR6R6’的杂种后代群体果实为试材,通过基因表达差异筛选候选基因,转基因愈伤组织(过表达和CRISPR-Cas9敲除)的功能验证,以及利用一系列分子生物学技术等手段开展本课题的研究,主要研究结果如下:1.通过对20skin biophysical parameters18年(145株)和2019年(132株)红肉苹果后代群体果实中糖组分(蔗糖、果糖、葡萄糖、山梨醇)和总糖含量分析,发现群体中糖含量差异丰富,对糖组分和总糖含量进行相关性分析,发现蔗糖与总糖的相关性最强。另外,我们分别筛选了3株性状稳定的极高糖和极低糖含量差异株系,对其发育期果实糖组Etoposide IC50分和总糖含量分析发现,蔗糖与总糖的含量也呈极显著相关,说明果实中蔗糖含量的积累对于红肉苹果杂种后代总糖含量十分重要。2.通过对糖含量差异株系发育期和红肉苹果后代株系果实中MdSWEETⅢ亚家族的8个成员基因表达分析,发现无论是在后代群体还是糖含量差异株系的发育期果实内,MdSWEET9b的表达水平与果实中糖含量都成显著相关性,因此本研究将MdSWEET9b作为候选基因,对其功能进一步挖掘和验证。3.通过在己糖转运缺失酵母突变体EBY.VW4000和蔗糖转运缺失突变体SUSY7/ura3中表达MdSWEET9b,发现MdSWEET9b可以特异性地将蔗糖运输到酵母细胞的细胞质中,从而恢复酵母突变体的生长。另外,通过检测MdSWEET9b转基因(过表达和CRISPR-Cas9敲除)‘Orin’愈伤组织中的糖含量发现,MdSWEET9b的过表达显著促进了愈伤组织中总糖积累,而敲除后使得愈伤组织中总糖含量明显降低,对糖组分的含量分析发现MdSWEET9b对蔗糖含量的影响是特异的,即MdSWEET9b可以主动的促进愈伤组织中蔗糖含量的累积,但同时它也会参与果糖和葡萄糖的积累,原位杂交和亚细胞定位试验结果显示MdSWEET9b位于果实维管束的筛管及其周围薄壁细胞的细胞质膜上发挥功能。4.通过酵母单杂、LUC、EMSA和Ch IP-PCR试验分别从体内和体外验证了Md WRKY9可以与MdSWEET9b发生相互作用。Md WRKY9可以特异的结合到MdSWEET9b启动子的W-box位点促进其活性。通过测定Md WRKY9转基因(过表达和CRISPR-Cas9敲除)愈伤组织中MdSWEET9b的表达水平和糖含量发现,Md WRKY9可以正调控MdSWEET9b的表达,促进愈伤组织中糖含量的积累。另外,对Md WRKY9和MdSWEET9b共转的愈伤组织中糖含量分析,进一步表明Md WRKY9主要通过调控MdSWEET9b的活性,促进果实糖含量的积累。5.通过对差异株系中ABA含量检测,以及ABA和ABA抑制剂(FLU)处理果实试验,发现ABA含量的高低是导致红肉后代群体糖含量差异的重要原因。在果实发育过程糖迅速积累的时期,ABA含量在高糖株系中迅速上升,而低糖株系中ABA含量变化不明显。RT-q PCR结果分析表明高糖株系中ABA合成和信号转导相关基因的表达量显著高于低糖株系,且外源ABA的处理显著促进低糖株系中糖含量的积累,FL确认细节U处理导致高糖株系中糖含量的积累量减少,这说明ABA信号在果实糖积累过程中具有重要作用。6.通过测定ABA和ABA抑制剂(FLU)处理果实中Md WRKY9和MdSWEET9b的表达量,发现ABA可以促进它们的表达。另外,对Md WRKY9转基因愈伤组织进行ABA和FLU处理后,通过分析基因表达水平和糖含量,表明ABA能够正调控Md WRKY9-MdSWEET9b途径来促进果实糖含量积累。7.通过酵母双杂试验对ABA信号通路中的相关基因与Md WRKY9蛋白进行特异互作筛选,发现Mdb ZIP23和Mdb ZIP46可以与Md WRKY9相互作用,随后的pull-down、Bi FC试验证实了该结果。另外,LUC和EMSA试验发现它们的这种相互作用增强了Md WRKY9对MdSWEET9b的调控活性。同时,我们分析Md WRKY9的启动子发现,其上存在b ZIP家族的结合位点,随后的EMSA和LUC试验发现Mdb ZIP23和Mdb ZIP46可以绑定到Md WRKY9启动子上,促进其活性,这进一步表明ABA信号通路对糖含量的影响可以通过调控Md WRKY9-MdSWEET9b的途径来实现。本研究表明了MdSWEET9b在果实糖积累过程中的作用,它的活性可受Md WRKY9转录调控。同时本文解析了Md WRKY9-MdSWEET9b通路响应ABA信号调控果实糖积累的作用机理,这为今后进一步探究SWEET糖转运蛋白的功能及激素与糖代谢之间的调控网络提供了新的思路。