目的在镉致胰岛β细胞死亡过程中明确m~6A修饰水平改变对内质网蛋白加工通路(PPER)信号分子的影响,解析m~6A修饰结合蛋白含YTH结构域蛋白2(Ythdc2)与PPER通路信号分子蛋白间的作用关系。方法1、硫酸镉(Cd SO_4)处理胰岛β细胞(NIT-1)后,采用CCK8实验检测细胞活性、Hoechst试剂盒检测胰岛β细胞细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测PPER通路信号分子如B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、转录因子C/EBP同源蛋白(Chop)、热休克蛋白40kd家族成员B1(Dnajb1)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、热休克蛋白90kdα家族成员A1蛋白(Hsp90aa1)、Ⅲ型胶原结构蛋白(Col3a1)以及X-盒结合蛋白1(Xbp1)等的m RNA水平,蛋白免疫印迹实验(WB)检测上述PPER通路信号分子的蛋白表达水平。2、以CCK8实验筛选确定m~6A激动剂恩它卡朋(Ent)的Abiotic resistance最佳处理浓度后,按对照组、20μmol/L Ent处理组、4μmol/L Cd SO_4组、20μmol/L Ent+4μmol/L Cd SO_4共处理组处理胰岛β细胞24 h,以RT-PCR和WB分别检测m~6A修饰水平增加对Cd SO_4诱导的PPER通路信号分子m RNA和蛋白表达水平改变的影响,计算Ent处理对Cd SO_4致PPER通路信号分子蛋白翻译效率变化的影响。3、以CCK8实验筛选确定m~6A抑制剂3-脱氮腺苷(DAA)的最佳处理浓度后,按对照组、25μmol/L DAA处理组、4μmol/L Cd SO_4组、25μmol/L DAA+4μmol/L Cd SO_4共处理组处理胰岛β细胞24 h,以RT-PCR和WB分别检测m~6A修饰水平抑制对Cd SO_4诱导的PPER通路信号分子m RNA和蛋白表达水平改变的影响;计算DAA处理对Cd SO_4致PPER通路信号分子蛋白翻译效率变化的影响。4、以WB实验检测m~6A修饰结合蛋白Ythdc2在Cd SO_4诱导胰岛β细胞死亡过程中水平变化情况,以Pearson相关性分析Ythdc2蛋白与PPER信号分子蛋白(Bcl-2、Bax、Chop、Dnajb1、Hsp90aa1、Xbp1以及Col3a1)表达水平变化间的相关性,采用蛋白免疫共沉淀(Co-IP)技术测定Ythdc2蛋白与PPEwww.selleck.cn/products/NolvadexR信号分子蛋白之间的相互作用情况,分析m~6A修饰水平改变对Ythdc2与PPER信号分子结合作用的影响。结果1、Cd SO_4致PPER通路蛋白表达水平变化:Cd SO_4暴露使胰岛β细胞活性降低,死亡增加,凋亡细胞随之增加。4μmol/L Cd SO_4处理后,Bcl-2、Xbp1和Col3a1蛋白表达为对照组的0.57、0.60以及0.67倍,差异具有统计学意义(P<0.05);Bax和Chop、Dnajb1和Hsp90aa1蛋白为Control组的1.78、1.74、1.67和1.93倍,表达水平显著增加(P<0.05)。2、m~6A激动剂Ent对Cd SO_4致PPER通路变化的影响:20μmol/L Ent与Cd SO_4共处理能显著增强Cd SO_4抑制的细胞活性,逆转Cd SO_4引起的细胞凋亡,并显著提高Cd SO_4处理组的m~6A修饰水平。Ent与Cd SO_4共处理后,Bcl-2、Xbp1和Col3a1蛋白表达水平为对照组的0.77、0.80、0.82倍,显著缓解了Cd SO_4处理引起的蛋白水平(0.57、0.60、0.69倍)降低,差异具有统计学意义(P<0.01);Ent与Cd SO_4共处理后,Bax、Chop、Dnajb1、Hsp90aa1蛋白表达水平为相应对照组的1.38、1.42、1.43、1.67倍,升高倍数显著低于Cd SO_4处理引起的蛋白水平升高(1.78、1.76、1.66、1.94倍),RT-PCR与WB实验结果变化趋势一致。3、m~6A抑制剂DAA对Cd SO_4致PPER通路变化的影响:25μmol/L DAA与Cd SO_4联合处理显著增强Cd SO_4致胰岛β细胞的死亡作用,加剧Cd SO_4引起的细胞活性降低,增加细胞凋亡,减少细胞m~6A修饰水平。WB实验结果显示,当DAA联合Cd SO_4进行处理后,Bcl-2、Xbp1、Col3a1蛋白表达水平减少为对照组的0.44、0.55、C59使用方法0.51倍,进一步加剧了Cd SO_4处理引起的蛋白水平(0.58、0.68、0.67倍)降低(P<0.01)。DAA联合处理也分别将Bax、Chop、Dnajb1和Hsp90aa1蛋白表达水平提升为对照组的2.08、2.11、1.91、2.16倍,显著加剧了Cd SO_4处理引起的蛋白水平上升(1.78、1.74、1.73、1.93倍)(P<0.01),RT-PCR与WB实验结果变化趋势一致。4、Ythdc2与PPER通路蛋白的互作情况:m~6A修饰结合蛋白Ythdc2表达水平在1、2、4μmol/L Cd SO_4组分别为对照组的0.93、0.80、0.59倍;Ythdc2与Bcl-2、Col3a1、Xbp1蛋白表达变化呈正相关,相关系数r分别为0.9447、0.9469以及0.9782;而Ythdc2与Bax、Chop、Hsp90aa1和Dnajb1蛋白表达变化之间存在较强的负相关关系,相关系数r分别为-0.9722、-0.98、-0.9576和-0.9692。在以Ythdc2抗体为结合蛋白的Co-IP实验中发现,Bcl-2、Xbp1、Col3a1蛋白在Cd SO_4组、Cd SO_4+DAA组以及Cd SO_4+Ent组的表达水平分别为对照组的0.58、0.42、0.77倍,0.66、0.52、0.85倍以及0.68、0.56、0.84倍,表明DAA共处理加剧了Cd SO_4引起的蛋白水平下降,而Ent共处理能显著缓解蛋白水平下降(P<0.05);同时,Bax、Chop、Dnajb1、Hsp90aa1蛋白在Cd SO_4组、Cd SO_4+DAA组以及Cd SO_4+Ent组的表达水平分别为对照组的1.68、2.10、1.40倍,1.75、2.00、1.49倍,1.61、1.95、1.41倍,以及1.92、2.09、1.70倍,表明DAA共处理促进了Cd SO_4引起的蛋白水平上升,而Ent共处理显著抑制了蛋白水平升高(P<0.05)。结论m~6A修饰参与镉引起的胰岛β细胞死亡过程,m~6A修饰水平的改变能显著影响PPER通路信号分子的表达,m~6A修饰结合蛋白Ythdc2也参与镉引起的胰岛β细胞死亡过程,且与PPER通路信号分子的变化存在相关性,并可能以m~6A修饰依赖的方式调控PPER信号通路分子。