第一部分IGF2BP2通过m6A甲基化调控NOTCH1介导T-ALL发生发展的机制研究研究背景急性T淋巴细胞白血病(T-acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)是一类以原始T淋巴细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻为特点的造血系统恶性疾病,严重威胁人类健康。近年来,随着治疗方法的不断发展,T-ALL的完全缓解率较前有所提高,但由于其原发性耐药及高复发率,成人T-ALL患者的5年生存率仅为35-40%。研究显示,T-ALL的发生发展与多种基因的异常表达、基因组改变以及表观遗传学异常密切相关。因此,破译T-ALL发生发展的分子机制,寻找特异性GSK1349572溶解度强的治疗靶点,研发新型靶向治疗药物,探索更为高效、低毒的治疗策略,是目前T-ALL基础与临床研究的热点。胰岛素样生长因子2信使RNA结合蛋白2(insulin-like growth factor 2 messenger RNA-binding protein 2,IGF2BP2)是一种在真核生物中高度保守的单链RNA结合蛋白。最初研究发现,该蛋白可通过参与mRNA的转录、加工、翻译和稳定性等阶段,协助mRNA定位,调节包括IGF2在内的多种基因的转录后翻译,并且其在生长发育、脂代谢及胰岛素抵抗等生物过程中发挥了重要作用。近年来,多篇报道证实IGF2BP2在肝细胞癌、食管腺癌、卵巢癌、乳腺癌和胶质母细胞瘤等多种恶性实体肿瘤中扮演促癌基因的角色。此外,研究显示IGF2BP2在急性白血病中亦具有重要地位,其在急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)中高表达,并参与AML细胞的增殖及化疗耐药等过程,但IGF2BP2对T-ALL的影响尚未见报道。因此,我们通过挖掘公共数据库数据发现:IGF2BP2的表达水平在T-ALL中明显升高,提示其可能在T-ALL的发生发展中发挥重要作用;并进一步探究了其在T-ALL中所发挥的具体作用及机制。N6-甲基腺苷(m6A)修饰是最具代表性的一种mRNA的转录后修饰,可以通过改变mRNA剪接、稳定性、易位和翻译来调节目的基因的表达水平。m6A甲基化修饰系统包括“写入器”、“橡皮擦”和“读取器”等3种组分,其中,“写入器”甲基转移酶复合物主要包括甲基转移酶样蛋白3和14(methyltransferase-like 3,METTL3和methyltransferase-like 4,METTL14)及其调节因子肾母细胞瘤1相关蛋白(Wilms tumor 1-associated protein,WTAP),执行“写入”m6A修饰;“橡皮擦”去甲基化酶主要包括脂肪量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)和酮戊二酸依赖性双加氧酶AlkB同系物5(alkB homolog 5,ALKBH5),负责去除m6A修饰。IGF2BP2作为一个新发现的m6A甲基化“Bioglass nanoparticles读取器”,其KH3-4结构域可识别多种mRNA序列上的m6A甲基化修饰位点,发挥稳定mRNA水平、促进翻译的作用。上述结果为IGF2BP2在T-ALL发生发展中所发挥作用的机制研究提供了新的探索方向。并且,目前国内外关于m6A甲基化修饰的报道多集中在AML,尚缺乏在T-ALL中的系统研究。m6A甲基化修饰在T-ALL的发生发展中的作用以及IGF2BP2介导的m6A甲基化修饰在其中扮演的角色仍未可知。研究目的1.揭示IGF2BP2在T-ALL的发生发展中发挥关键的促癌作用。2.阐明IGF2BP2可直接调控NOTCH1的表达从而促进T-ALL的发生发展。3.明确IGF2BP2通过m6A甲基化修饰调控NOTCH1表达的具体机制与位点。4.筛选特异性靶向结合并抑制IGF2BP2活性的小分子抑制剂,体内外探讨IGF2BP2抑制剂用于T-ALL治疗的可行性。研究方法1.筛选公共数据库数据,证实IGF2BP2在T-ALL中的表达水平,同时在本临床www.selleck.cn/products/s63845中心收集的T-ALL患者样本中进行验证。2.通过小干扰RNA(siRNA)下调或者慢病毒上调了 T-ALL细胞系Jurkat及Molt4中IGF2BP2的表达水平,利用CCK8实验检测细胞增殖比例,细胞周期实验检测细胞周期分布,药敏实验和流式细胞凋亡实验检测细胞对化疗药物的敏感性。3.构建IGF2BP2基因稳定敲除T-ALL细胞系和对照转染空载细胞系,尾静脉注射并构建IGF2BP2敲除型及野生型T-ALL免疫缺陷小鼠模型。定期观察小鼠模型的生存情况、毛色、体重等,并进行外周血细胞计数。模型小鼠发病后,制备骨髓及外周血涂片,肝、脾和骨髓组织样本进行H&E染色,通过流式细胞术检测了小鼠外周血、骨髓、肝脾中白血病细胞的负荷情况。并且观察记录了两组小鼠的生存情况。4.IRIP-seq和RNA-seq测序结果共同筛选IGF2BP2的下游分子及通路,并通过IGF2BP2 RIP-qPCR和Western Blot(WB)实验验证IGF2BP2和下游分子的直接结合,恢复实验进一步验证IGF2BP2对下游分子的直接调控作用。5.IRIP-seq和MeRIP-seq测序结果共同确定IGF2BP2作为m6A甲基化“读取器”对下游分子的调控方式及具体的调控位点,并通过MeRIP-qPCR,RNA-Pulldown,RNA稳定性及WB等实验验证IGF2BP2对下游分子的具体调控机制及作用位点。6.基于IGF2BP2结构设计特异性靶向结合的小分子抑制剂。首先利用IGF2BP2的KH3-4结构域(KH3-4结构域介导IGF2BP2与RNA的相互作用)进行计算机虚拟筛选,寻找可能与IGF2BP2相互作用的小分子化合物,然后通过体外实验进一步筛选可以结合并抑制IGF2BP2活性的小分子抑制剂。7.在IGF2BP2过表达或敲除的T-ALL细胞系中评价小分子抑制剂对细胞生物学功能的影响,RT-qPCR验证其对细胞中IGF2BP2 mRNA表达水平的影响,并进一步在T-ALL免疫缺陷小鼠模型中证实IGF2BP2小分子抑制剂的体内疗效。研究结果1.通过T-ALL相关公共数据集发现了 IGF2BP2在T-ALL标本中表达水平显著升高,本中心收集的T-ALL患者标本的qPCR及WB结果也证实:IGF2BP2的表达水平在T-ALL患者中显著升高。2.敲低T-ALL细胞系Jurkat和Molt4中IGF2BP2的表达水平能够显著抑制细胞增殖、延缓细胞DNA复制速率,使细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞凋亡的比例也相应的增加。相反,上调T-ALL细胞系Jurkat和Molt4中IGF2BP2的表达促进了细胞增殖,减弱了细胞对化疗药物的敏感性。3.相对于野生型T-ALL小鼠,IGF2BP2敲除的T-ALL小鼠的外周血、骨髓及肝脾中白血病细胞浸润明显减少,白血病负荷显著降低,小鼠生存时间明显延长。4.iRIP-seq测序和RNA-seq测序结果共同筛选并确定出IGF2BP2下游分子NOTCH1,IGF2BP2 RIP-qPCR 和 WB 结果验证了 IGF2BP2 对 NOTCH1 mRNA 的直接调控作用;并在NOTCH1表达上调的T-ALL细胞系中下调IGF2BP2的表达,结果发现IGF2BP2的下调在一定程度上减轻了 NOTCH1过表达的促增殖功能,进一步证实了上述结论。5.通过 IGF2BP2 RIP-qPCR、MeRIP-qPCR 和 RNA 稳定性实验证实了 IGF2BP2 通过m6A甲基化修饰直接调控NOCTH1的表达水平;进一步交叉分析IRIP-seq测序和MeRIP-seq测序的数据,确定了 IGF2BP2作为m6A甲基化“读取器”对下游分子NOTCH1的具体调控位点,并通过RNA-Pull down实验反向验证了上述结果。6.利用SPECS数据库进行基于蛋白分子对接的虚拟筛选,选取了 22个可能与IGF2BP2直接结合的小分子药物,荧光滴定技术进一步筛选了可以直接结合并抑制IGF2BP2活性的小分子药物,并通过RT-qPCR、CCK8实验、流式细胞凋亡实验证实了其可靶向结合T-ALL细胞内IGF2BP2蛋白,并且其可抑制T-ALL细胞增殖,诱导T-ALL细胞凋亡。7.在IGF2BP2过表达或敲除的T-ALL细胞系中进行的JX5药物敏感性实验进一步确定了 JX5可通过与IGF2BP2直接结合来抑制其功能。此外,利用小分子药物JX5腹腔注射治疗T-ALL免疫缺陷小鼠,结果证实:经过JX5治疗后,小鼠骨髓及脾脏中白血病细胞的负荷情况显著减轻。研究结论1.T-ALL中IGF2BP2高表达,可通过调控NOTCH1的表达来促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,同时减弱细胞对化疗药物的敏感性;体内敲除IGF2BP2可显著延缓T-ALL小鼠的发病,延长小鼠的生存时间,说明IGF2BP2在T-ALL中发挥至关重要的促癌作用。2.IGF2BP2通过调控NOTCH1 mRNA上m6A位点的甲基化修饰,增强NOTCH1 mRNA的稳定性,从而促进NOTCH1的表达。3.特异性靶向结合IGF2BP2的小分子药物JX5可抑制T-ALL细胞增殖、诱导细胞凋亡;腹腔注射JX5治疗可有效延缓T-ALL小鼠发病,显著降低小鼠体内白血病细胞的负荷,提示靶向IGF2BP2的小分子药物JX5有望成为治疗T-ALL的新型靶向药物。第二部分YAP1的乙酰化修饰调控DNA损伤修复在FLT3-ITD突变AML中的作用及机制研究研究背景急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种起源于髓系造血系统的高度异质性的恶性克隆性疾病,严重威胁人类健康。大约30%的AML患者存在FLT3-ITD突变,伴有这类突变的患者化疗诱导缓解率低、复发率高且生存期短。临床研究发现,多种酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)如索拉非尼(Sorafenib)、米哚妥林(Midostaurin)、奎扎替尼(Quizartinib,AC220)、吉列替尼(Gilteritinib)等对 FLT3-ITD突变AML均有一定的治疗作用,但随着TKI在临床上的应用和时间的推移,其耐药现象日益明显,复发率逐渐增高,严重影响FLT3-ITD突变AML的治疗效果。寻找介导耐药的关键分子、探究耐药的发生机制是当前FLT3-ITD突变AML临床及基础研究的热点。Hippo/YAP通路是近年来研究的热点,是一条高度保守的生长控制信号通路,可通过调节细胞增殖和凋亡的平衡,参与调控器官大小、组织再生、干细胞自我更新及分化。YAP1为Hippo通路下游的主要效应分子。近来研究证实,YAP1能通过调控其下游肿瘤相关基因的表达,促进肿瘤细胞的增殖、恶性转化、侵袭转移和耐药,在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥促癌作用。另一方面,YAP1低表达的骨髓瘤患者生存期明显缩短,YAP1可通过促进肿瘤细胞凋亡在多发性骨髓瘤中发挥抑癌作用。因此,YAP1在不同类型肿瘤的发生发展过程中可发挥促癌或者抑癌作用。目前有关YAP1在白血病中发挥作用的途径及机制仍不清楚,且YAP1对FLT3-ITD突变AML发病及耐药的影响尚无研究报道。乙酰化是发生在组蛋白和其他蛋白质的赖氨酸残基上的一种重要的蛋白翻译后修饰,也是一种常见的表观遗传调控机制,其在基因表达调控过程中发挥了至关重要的作用。组蛋白乙酰基转移酶(Histone acetyltransferases,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)两者共同调控了组蛋白的乙酰化修饰水平,同时维持着正常的染色体结构。HATs促进转录因子与DNA模板相结合,激活转录;而HDACs可降低组蛋白的乙酰化水平,导致染色质结构紧缩,阻碍转录因子与DNA结合,从而抑制转录激活,二者共同影响细胞分化、凋亡过程,且与肿瘤的发生发展密切相关。已有研究显示,YAP1存在经典的磷酸化和泛素化修饰,导致其阻滞于细胞质中并被降解失活。然而,细胞核内调节YAP1蛋白翻译后修饰的具体方式及作用位点仍不清楚。我们前期研究发现,YAP1启动子区H3K27是其发生乙酰化修饰的氨基酸位点,且去乙酰化酶抑制剂可上调AML细胞中YAP1表达,说明AML中YAP1可能存在新的乙酰化修饰调控机制,有待进一步探索。研究目的1.明确YAP1在FLT3-ITD突变AML的发病及耐药中发挥重要的抑癌作用,阐明YAP1可通过调控DNA损伤修复蛋白PARP1的表达从而介导FLT3-ITD突变AML的发生发展。2.探索FLT3-ITD突变AML中去乙酰化修饰调控YAP1表达的具体机制,并探讨去乙酰化酶抑制剂西达本胺靶向YAP1用于FLT3-ITD突变AML治疗的可行性。研究方法1.筛选公共数据库数据,研究YAP1在FLT3-ITD突变AML中的表达水平,同时在本临床中心患者样本中验证YAP1在耐药FLT3-ITD突变AML患者中的表达情况。2.利用FLT3抑制剂索拉菲尼诱导FLT3-ITD突变AML细胞系MV4-11及MOLM13,建立耐药细胞系,RT-qPCR和WB检测YAP1的表达水平。3.慢病毒上调FLT3-ITD突变AML细胞系MV4-11及MOLM13中YAP1的表达,利用CCK8实验检测细胞增殖比例,流式细胞凋亡术检测凋亡细胞的比例,药物敏感性实验和药物诱导的细胞凋亡实验检测细胞对化疗药物的敏感性。4.蛋白质谱分析筛选YAP1下游分子及通路,并通过RT-qPCR和WB实验验证。利用PARP1抑制剂和YAP1小干扰RNA进行恢复实验进一步确认YAP1对细胞增殖能力的调控是否依赖于PARP1的表达水平。5.RNA-seq测序数据分析筛选并WB验证FLT3-ITD突变AML细胞耐药相关的关键分子HDAC10。应用去乙酰化酶抑制剂西达本胺抑制HDAC10去乙酰化酶活性,并进行CCK8实验检测细胞增殖功能和药物诱导的流式细胞凋亡实验检测其对FLT3抑制剂药物敏感性的影响。6.利用去乙酰化酶抑制剂西达本胺或小干扰RNA下调HDAC10的表达,WB检测HDAC10和YAP1的蛋白表达水平。进一步分离MV4-1细胞中的膜蛋白和核蛋白,通过WB和免疫共沉淀(CO-IP)实验验证细胞核YAP1的乙酰化修饰调控方式及具体位点。7.利用去乙酰化酶抑制剂西达本胺和多种FLT3抑制剂的联合方案处理初诊和耐药FLT3-ITD突变AML患者的原代细胞,探索利用西达本胺上调YAP1的表达联合FLT3抑制剂治疗耐药FLT3-ITD突变AML的可行性。研究结果1.生物信息学分析GEO和TCGA中AML相关数据集,结果发现AML患者中YAP1表达水平显著低于正常对照;FLT3-ITD突变AML患者的YAP1表达水平较FLT3-ITD未突变AML患者更低。2.RT-qPCR和WB实验验证了 FLT3抑制剂耐药MV4-11及MOLM13细胞中,YAP1的表达水平明显减低。临床患者标本RT-qPCR的结果也证实了 YAP1在耐药FLT3-ITD突变AML患者中表达受抑。3.上调FLT3-ITD突变AML细胞系MV4-11及MOLM13中YAP1的表达,显著抑制了细胞增殖,促进了细胞凋亡,明显增强了细胞对FLT3抑制剂和传统化疗药物的敏感性。4.蛋白质谱分析筛选出DNA损伤修复蛋白PARP1是YAP1下游分子之一,并通过RT-qPCR和WB实验验证。此外,利用PARP1抑制剂和YAP1小干扰RNA进行恢复实验进一步确认了 YAP1对细胞增殖能力的调控依赖于PARP1的表达水平改变。5.RNA-seq测序数据分析筛选确定了 FLT3-ITD突变AML细胞耐药相关的关键分子HDAC10,WB实验证实了 HDAC10在耐药FLT3-ITD突变AML细胞中低表达。并且应用去乙酰化酶抑制剂西达本胺可通过负向调控HDAC10/YAP1轴,增强细胞对FLT3抑制剂的药物敏感性。6.西达本胺或小干扰RNA相关细胞实验证实了 HDAC10作为去乙酰化酶,可通过去乙酰化修饰负向调控YAP1的表达。CO-IP和细胞膜/核蛋白WB实验阐明了 HDAC10可通过H3K27位点调控YAP1的乙酰化,同时促进YAP1分子转录入核,激活下游基因PARP1。7.去乙酰化酶抑制剂西达本胺和FLT3抑制剂的联合方案可明显促进初诊和耐药FLT3-ITD突变AML患者原代细胞的凋亡,证明了西达本胺联合FLT3抑制剂治疗FLT3-ITD突变AML的可行性。研究结论1.AML患者中YAP1表达水平显著低于正常对照。同时,YAP1在耐药FLT3-ITD突变AML患者中也表达受抑。2.YAP1在FLT3-ITD突变AML发病和耐药中发挥抑癌作用。YAP1可通过调控DNA损伤修复蛋白PARP1的表达水平抑制FLT3-ITD突变AML细胞的增殖,促进细胞凋亡并增强细胞对FLT3抑制剂及化疗药物的敏感性。3.HDAC10可通过调控YAP1组蛋白上H3K27位点的乙酰化水平,抑制YAP1的出核、转录和翻译,从而抑制YAP1的表达。4.去乙酰化酶抑制剂西达本胺可明显增强FLT3-ITD突变AML细胞系对FLT3抑制剂和传统化疗药物的敏感性,西达本胺与FLT3抑制剂或传统化疗药物的联合治疗在FLT3-ITD突变AML患者的原代细胞中展现出显著的临床疗效。