奶牛繁殖率极大程度上影响奶牛群的持续发展,直接关系着奶牛场的生产效益。早期胚胎丢失是导致许多集约化奶牛场产犊率较低的重要因素之一。过去几十年来,虽然科学技术研究使得奶牛的繁殖率有了显著的提高,但由于技术条件受限和高昂的研究成本等原因使得我们对奶牛早期妊娠复杂的母胎机制的认识仍然尚浅。子宫内膜容受性是胚胎植入的关键,子宫内膜炎或子宫内膜免疫微环境紊乱等不良因素导致的植入失败会影响妊娠的正常进行。资料显示,铁死亡是一种新型的细胞死亡形式,与机体多种生物学疾病的发展过程联系密切。然而,现有对铁死亡的报道主要集中在肿瘤治疗上,而在生殖疾病,特别是早期妊娠失败方面的研究还尚不清楚。本研究通过分子动力学模拟、生物信息学分析、稳转细胞系构建和模式动物在体研究等手段,利用分子对接、免疫共沉淀(CO-IP)、腺相关病毒转染、RTCA DP实时细胞分析、免疫荧光(IF)和pull down等技术,系统的研究了妊娠早期IFNτ发挥作用的新型互作靶蛋白,RIPOR2参与铁死亡的下游信号通路及重要蛋白的表达变化等,旨在阐明IFNτ终止铁死亡引起的早期妊娠失败的具体调控机制,拓展了IFNτ在妊娠免疫中的新见解,为提高奶牛繁殖率提供了新的科学依据。本研究具体的研究结果如下:1.RIPOR2作为IFNτ抑制铁死亡的媒介本研究筛选了妊娠早期IFNτ区别于IFNα的独特互作靶蛋白RIPOR2,建立了IFNτ和RIPOR2的三维结构模型。蛋白质结构对接显示,IFNτ的一段α-Helix结构完全嵌入RIPOR2表面空腔中,形成了16组氢键,使两个蛋白间能稳定结合。并进一步通过CO-IP实验验证了IFNτ与RIPOR2的互作关系。为了探究IFNτ与铁死亡的作用关系,本文首先通过相关性热图分析表明了胚胎植入与铁死亡相关基因之间具有明显相关性,初步推断铁死亡会影响妊娠早期正常的生理行为。接下来通过Erastin诱导体外组织培养铁死亡模型发现,IFNτ干预会显著逆转铁死亡所引起的FTH1、GPX4和PTGS2表达水平的异常变化,并促进了组织铁含量和MDA的降低和GSH的升高。随后,进一步研究表明铁死亡会抑制RIPOR2的表达,干扰RIPOR2加重了铁死亡所造成的损伤,抑制了LIF和ITGB3的表达。IFNτ不仅升高了LIF和ITGB3的表达水平,还抑制了铁死亡所引起的细胞膜破裂和微绒毛损伤。以上结果表明,IFNτ通过促进RIPOR2的表达抑制妊娠早期铁死亡。2.IFNτ通过ROCK1/p38/JNK1途径抑制铁死亡为了深入探究RIPOR2在铁死亡中所发挥的作用,本文使用腺相关病毒构建了RIPOR2敲低稳转子宫内膜上皮细胞系。通过RNLorlatinib分子式A测序分析了IFNτ对Erastin诱导的铁死亡模型中差异最显著基因的影响。ROCK1/2作为RIPOR2发挥作用的下游效应因子,铁死亡会促进ROCK1与ROCK2的表达,但在IFNτ干预下却只对ROCK1有显著影响,而对ROCK2影响较小。且进一步实验表明,IFNτ会通过ROCK1促进GPX4和FTH1表达的同时抑制PTGS2的表达。KEGG分析显示,MAPK通路富集最显著。且通过数据分析发现,MAPK通路成员中MAPK8(p38)和MAPK12(JNK1)变化幅度最大。在阻断ROCK1后,铁死亡诱导的p-p38和p-JNK1的蛋白表达和核易位程度显著减少,而这一作用被IFNτ协同增强。此外,本研究还发现,铁死亡会紊乱线粒体网络,显著增加了细胞核周围呈碎片或点状的线粒体数量。而IFNτ通过调节ROCK1的表达维持了线粒体网络的完整性,减弱了铁死亡对细胞的杀伤程度。以上结果表明,IFNτ通过抑制ROCK1/p38/JNK1通路激活缓解了铁死亡对细胞的氧化损伤。3.IFNτ终止铁死亡引起的早期妊娠失败为了进一步在在体探究IFNτ与RIPOR2在铁死亡中的功能关系,首先用腺相关病毒敲低小鼠体内RIPOR2的表达。并以此为基础,用PA-Erastin建立Trichostatin A细胞培养了小鼠妊娠早期子宫内膜铁死亡模型。IFNτ增强了子宫内膜上皮GPX4和抑制了PTGS2的表达。并对子宫内膜组织和外周血血清中铁含量的过度升高起到很好的抑制作用。在另一方面,IFNτ显著抑制了p-p38和p-JNK1的表达,并降低了其在子宫内膜上皮细胞的细胞核里的荧光密度。为了排除个体间差异,本研究通过自体对照探究IFNτ对早期妊娠的影响。结果证实,IFNτ阻止了铁死亡对小鼠妊娠早期胚胎植入的不良影响,保证了正常的胚胎植入。RT-q PCR结果表明,LIF和ITGB3的表达在IFNτ干预下显著升高。LIF的荧光表达水平也展现出相似的结果。以上结果表明,IFNτ通过抑制铁死亡维持小鼠早期妊娠的正常进行。结论:IFNτ通过促进RIPORmedium- to long-term follow-up2的表达抑制ROCK1/p38/JNK1通路的激活,缓解铁死亡引起的氧化损伤,终止早期妊娠失败。