侧线系统是鱼类和两栖类特有的感觉器官。鱼类可以通过侧线系统感应周围水体的变化,从而进行捕食、避敌、趋流和洄游等行为活动,这对鱼类的生存具有重大意义。神经丘是构成侧线系统的基本结构,它主要是由毛细胞、支持细胞和套细胞组成。人类内耳中的毛细胞与斑马鱼侧线系统中的毛细胞极为相似,但在再生方面却有所不同。成熟哺乳动物内耳中的毛细胞,一旦受损便不可再生,而斑马鱼侧线系统的毛细胞却可以再生。因此探究斑马鱼侧线系统的发育在人类听力受损治疗方面具有重要意义。HIF信号通路是细胞在低氧条件下,由低氧诱导因子(hypoxia-inducible factors,HIFs)介导,启动下游基因表达的信号通路。目前,大量研究表明该信号通路参与血管、肾脏和软骨等多种器官和胚胎发育过程。但对于斑马鱼侧线毛细胞的发育知之甚少。本研究则是围绕着HIF信号通路是否参与斑马鱼侧线发育展开。首先,我们利用抑制脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase domain-containing proteins,PHD)的小分子化合物二甲基草酰甘氨酸(dimethyloxallyl glycine,DMOG)激活斑马鱼HIF信号通路,结果发现过度激活HIF信号通路,斑马鱼不仅表现出一些低氧反应,侧线上神经丘面积和毛细胞数量也显著减少,初步断定过度激活HIF信号通路不利于斑马鱼的侧线发育。另外,我们使用CRISPR/Cas9技术成功构建了HIF信号通路相关的基因突变鱼,包括vhl~(-/-)突变体、hif1aa~(-/-);hif1ab~(-/-)(简称:hif1α~(-/-))双突变体和epas1a~(-/-);epas1b~(-/-)(简称:epas1~(-/-))双突变体。我们分别利用YO-PRO-1和Sox2分别标记毛细胞和支持细胞对此三种突变体的侧线发育进行检测,结果发现3 dpf和5 dpf vhl~(-/-)突变体的毛细胞和支持细胞数量均显著少于野生型斑马鱼。此结果与DMOG处理所得结果一致,这表明过度激活HIF信号通路不利于斑马鱼侧线的发育。另外hif1α~(-/-)双突变体和epas1~(-/-)双突变体侧线毛细胞的数量和野生型斑马鱼都没有显著差异。q PCR检测发现,hif1α~(-/-)双突变体中epas1a的m RNA水平明显上调,同时epas1~(-/-)双突变体中hif1aa和hif1ab的m RNA水平明显上调,表明hif1α~(-/-)双突变体和epas1~(-/-)双突变体的毛细胞没有发生变化可能是由于HIFs家族成员间存在互相代偿作用。为进一步明确vhl突变体和DMOG处理是否通过Epas1和Hif1α蛋白影响侧线毛细胞的发育,我们利用HIF-1α抑制剂PX-478对vhl~(-/-)突变体进行处理,结果发现PX-478可以部分拯救vhl~(-/-)突变体毛细胞的减少。同时,我们利用DMOG处理epPD-0332991as1~(-/-)双突变体和野生型鱼,结果发现epas1~(-/-)双突变体的毛细胞数量显著大于野生型斑马鱼。结果表明,epas1a和epas1b的双突变部分拯救了DMOG诱导低氧反应所带来的斑马鱼侧线毛细胞的减少。为进一步探究过度激活HIF信号通路导致支持细胞和毛细胞减少的原因,我们利用Brd U标记3 dpf到5 dpf仔鱼的增殖细胞,同时用Sox2抗体标记神经丘支持细胞,通过共定位标记确定增殖的支持细胞。结果显示,vhl~(-/-)突变体增殖支持细胞数量显Blebbistatin半抑制浓度著少于野生型和杂合子突变体(vhl~(+/+)和vhl~(+/-))。这表明激活HIF信号通路抑制了神经丘支持细胞的增殖。为探究HIF信号通路影响毛细胞发育的具体机制,我们通过q PCR检测了Serologic biomarkersvhl~(-/-)突变体中Wnt信号靶基因(lef1)和Wnt信号下游转录因子Atoh1(包括atoh1a和atoh1b基因)的表达情况,发现lef1和atoh1a基因的m RNA水平明显下降。另外,我们利用Wnt信号转基因报告鱼Tg(7x TCF-Xla.Sim:GFP)探究过度激活HIF信号通路是否会对Wnt信号产生影响。结果显示,当使用DMOG激活HIF信号通路后,转基因鱼Tg(7x TCF-Xla.Sim:GFP)神经丘上的荧光信号显著减少。结果表明:过度激活HIF信号通路通过抑制Wnt信号造成神经丘毛细胞的减少。综上所述,我们发现激活HIF信号通路会通过抑制Wnt信号抑制斑马鱼侧线毛细胞的发育;抑制Epas1和Hif1α蛋白可以部分挽救由于HIF通路的过度激活而造成的毛细胞损失。这些工作为理解氧气和低氧信号在斑马鱼侧线毛细胞发育中的作用奠定了基础,为利用氧气促进哺乳动物中毛细胞的保护和修复提供了理论支持。