动脉粥样硬化性疾病,如心肌梗塞和中风,这类疾病的发病率和死亡率较高,已成为导致人类死亡的主要原因之一。经皮冠状动脉介入术(Percutaneous coronary intervention,PCI)是目前治疗动脉粥样硬化的有效手段之一。但是PCI会导致术后再狭窄,SB431542供应商影响其疗效。因此了解再狭窄的病理发生过程是非常重要的。与进行性胆固醇诱导的动脉粥样硬化不同,新生内膜增生在冠状动脉血管成形术后再狭窄的发病机制中起着重要作用。研究发现血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)的表型会发生异常改变,如血管损伤或者受到一些病理生理因子的刺激:血小板源生长因子-BB(Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)、血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)、转化生长因子β(Transforming growth factorβ,TGF-β)等导致VSMCs从收缩分化状态转变为增殖、迁移的合成形态进而促进了新生内膜的形成。因此,探讨VSMCs异常的增殖迁移在新生内膜增生导致的血管性疾病的预防中具有重要意义。成纤维细胞生长因子同源性因子(Fibroblast growth factor homologous factors,FHFs)是成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)家族中的特殊一员。其功能与传统的FGF不同。虽然FHFs和FGF家族中其他成员在结构和序列上有一定相似,但其氨基端上缺乏分泌信号序列,故FHFs不能分泌到细胞外,也不能激活相应的FGF受体,在细胞内发挥着重要作用。有文献表明FHFs家族在血管中发挥着重要作用,如缺氧诱导的FGF11刺激毛细血管样内皮管的形成;过表达FGF12抑制颈总动脉损伤诱导的血管内膜的增生。我们前期研究发现FHFs家族成员FGF13在血管组织中有较高的表达,过表达FGF13可抑制大鼠高血压模型诱导的血管重构。那么FGF13对颈动脉新生内膜是否有影响,目前并不清楚。本课题中,我们分别从动物实验和细胞实验探索了FGF13对颈动脉新生内膜的影响。首先我们构建了血管损伤模型,探讨血管平滑肌细胞上特异性敲除FGF13(Smooth muscle cell-FGF13~(-/-),SMC-FGF13~(-/-))小鼠对颈动脉损伤后内膜增生的影响,之后在大鼠VSMCs上构建细胞增殖模型,探讨FGF13对VSMCs收缩、增殖和迁移的影响。目的:通过构建小鼠左颈动脉内膜增生模型,探讨SMC-FGF13~(-/-)对血管内膜增生的影响。方法:1.利用左颈总动脉结扎术(Carotid artery ligation,CAL)构建小鼠血管内膜增生模型,分别于术前、术后14天、21天、28天取材、冰冻切片进行苏木精伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,H&E)、Image J软件进行形态学测量分析管腔面积、内膜面积、中膜面积及内膜和中膜面积之比验证模型是否成功。2.利用RT-PCR、Western blot技术探究血管内膜增生模型状态下FGF13的表达变化。3.野生型(Wild type,WT)小鼠和SMC-FGF13~(-/-)小鼠构建血管内膜增生模型,术后14天取材进行H&E染色、Image J进行形态学测量观察敲除FGF13对血管内膜增生的影响。4.体外培养大鼠原代VSMCs,取3-5代的VSMCs通过腺病毒过表达FGF13,RT-PCR检测FGF13的过表达效率。5.Cell Counting Kit-8(CCK8)法检测PDGF-BB对细胞活性的影响,以不同浓度的药物(0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40ng/mL、50 ng/mL)PDGF-BB刺激VSMCs 24 h,摸索最佳药物浓度。6.RT-PCR、Western blot技术分别检测control、PDGF-BB、腺病毒过表达FGF13(Adenovirus-FGF13,Ad-FGF13)、Ad-FGF13+PDGF-BB组中收缩、增殖、迁移标志性的Markerα平滑肌肌动蛋白(alpha-Smooth muscle actin,α-SMA)、增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9,MMP9)的m RNA含量和蛋白表达。结果:1.H&E染色结果显示术后14天、21天、28天血管内膜逐渐增厚、管腔逐渐狭窄。形态学计量显示术后14天、21天、28天管腔面积显著减少,内膜面积显著增大,中膜面积显著增大,内膜/中膜面积显著增大,证明模型构建成功。2.RT-PCR、Western blot结果发现术后14天FGF13的mRNA含量和蛋白表达在野生小鼠左侧结扎颈总动脉组织中明显降低。3.WT小鼠和SMC-FGF13~(-/-)小鼠结扎14天后取材,H&E染色结果发现相比WT小鼠结扎组,SMC-FGF13~(-/-)小鼠结扎组中血管中膜排列紊乱,内膜明显增厚,管腔明显狭窄。形态学测量分析显示,相比WT小鼠结扎组,SMC-FGF13~(-/-)小鼠结扎组管腔面积明显减少,内膜面积明显增大,中膜面积,内膜和中膜面积之比也是明显增大。这提示SMC-FGF13~(-/-)小鼠可促进血管损伤诱导的内膜增生。4.3-4天时在少量血管组织周围会爬出VSMCs,8-9天VSMCs生长汇合至80%-90%时,呈典型的“峰谷”现象。RT-PCR结果显示,腺病毒过表达FGF13组中FGF13的m RNA含量明显增加,提示过表达效率良好。5.CCK8结果显示,相比0 ng/mL,药物在10 Medical geologyng/mL-50 ng/mL时细胞活性均明显增加,且在40 ng/mL时更加明显,因此确定40 ngTofacitinib体内/mL PDGF-BB是最佳药物刺激浓度。Western blot结果显示,过表达FGF13能够促进α-SMA蛋白的表达,此外能够明显缓解PDGF-BB对α-SMA的抑制作用。6.RT-PCR、Western blot结果显示过表达FGF13能够抑制PCNA的mRNA含量和蛋白表达,此外能够明显抑制PDGF-BB对PCNA的诱导作用。7.RT-PCR、Western blot结果显示过表达FGF13能够抑制MMP9的mRNA含量和蛋白表达,此外能够明显抑制PDGF-BB对MMP9的诱导作用。结论:1.本实验成功构建了血管内膜增生模型。2.RT-PCR、Western blot结果发现在WT小鼠左侧颈动脉结扎术后FGF13的表达下降。3.H&E染色结果显示血管平滑肌细胞特异性敲除FGF13小鼠可促进血管损伤诱导的内膜增生。4.体外成功培养大鼠VSMCs。RT-PCR结果显示腺病毒成功过表达FGF13。5.RT-PCR、Western blot结果显示过表达FGF13促进VSMCs的收缩,抑制VSMCs的增殖、迁移。