肾综合征出血热(Hemorrhagic Fever with RenalPS-341供应商 Syndrome,HFRS)是由汉坦病毒感染引起的急性传染病。HFRS呈全球性流行,严重危害社会和公共卫生,影响人类的健康与生命。中国是受HFRS威胁最严重的地区,全球90%的HFRS病例发生在我国,预防及治疗HFRS成为亟需解决的问题。根据汉坦病毒天然宿主的地理分布,在中国引起HFRS的主要病原体为汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV),而其感染机制尚未完全揭示。目前应对HFRS主要采取支持治疗,尚无FDA批准的疫苗或特异性抗病毒药物。因此,还需进一步加强对HTNV感染机制的认识。表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)是一种受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase,RTK),广泛表达在全身的表皮细胞中。在配体的刺激下,可激活下游信号级联反应,调控细胞的增殖、生长及迁移。一系列研究表明,EGFR不仅与癌症的发Liproxstatin-1分子式生息息相关,还广泛参与多种病毒感染。许多病毒利用EGFR的内吞作用及其介导的信号通路,调控其入侵、复制过程或抵抗宿主内免疫反应,如HCV、ZIKV、HBV、TGEV、HCMV、HSV、IAV等。但EGFR与HTNV感染之间的关系,目前尚无研究报道。作者前期研究发现EGFR能影响HTNV子代病毒的产生,但其作用机制并不清楚。因此本课题通过揭示EGFR在HTNV感染过程中的作用,为抗HTNV特异性药物的筛选提供理论基础,具有重要的临床意义。EGFR影响HTNV子代病毒产生主要包含两方面,一方面是EGFR调控HTNV的入侵;另一方面是EGFR直接影响HTNV在细胞内的复制。为了进一步验证EGFR对HTNV子代病毒产生的影响,本课题首先利用HTNV感染过表达、敲低和敲除EGFR的稳转细胞,通过Western blot、RT-q PCR、空斑实验等方法发现过表达EGFR明显促进HTNV核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)的表达、S节段的复制及子代病毒的产生;而敲低或敲除内源性的EGFR后均能抑制HTNV NP的蛋白表达、核酸复制及子代病毒产生。以上结果表明EGFR不仅影响HTNV子代病毒产生,而且调控HTNV NP蛋白在细胞内的表达及核酸复制。随后,本研究利用经典的病毒结合与进入实验,分别检测在4℃和37℃条件下结合到细胞表面与内化到细胞中的病毒量。结果显示过表达或敲低EGFR都不影响HTNV与宿主细胞结合,但是过表达EGFR时内化到细胞中的病毒增加;而敲低EGFR则内化的病毒减少,表明EGFR可能参与HTNV入侵环节。最后,作者利用HTNV感染过表达EGFR胞内结构域的稳转细胞株,检测到HTNV的复制水平依然升高,推测EGFR胞内区域可能参与HTNV复制。病毒minigene复制子系统是有效检测靶基因对病毒转录和复制影响的工具。作者利用汉滩病毒minigene报告系统,检测EGFR是否参与Research Animals & AccessoriesHTNV基因组的转录与复制过程。结果表明EGFR明显促进HTNV基因组的转录与复制,并且发现EGFR胞内区域的激酶结构域是促进病毒基因组转录与复制的关键结构域。EGFR K745是EGFR发挥激酶活性的关键氨基酸。作者通过过表达EGFR Cyto K745A突变体,发现K745A的突变能减弱EGFR胞内区域对HTNV复制的影响。埃罗替尼(Erlotinib)是一种特异性靶向EGFR激酶结构域的酪氨酸激酶抑制剂。在感染HTNV的A549细胞中加入不同浓度的Erlotinib,结果显示Erlotinib对HTNV复制的抑制呈剂量依赖性,表明EGFR的激酶活性对其功能的发挥具有重要作用。为了进一步探究EGFR增强HTNV复制的机制,作者检测了HTNV结构蛋白NP是否与EGFR相互作用。免疫共沉淀实验发现EGFR胞内结构域在瞬时转染和病毒感染时均与HTNV NP存在相互作用;并且通过免疫荧光也证实了EGFR与HTNV NP在细胞内存在共定位。分别利用EGFR和HTNV NP的截短突变体进行免疫共沉淀并结合GST pulldown实验,鉴定出EGFR的激酶结构域是与HTNV NP相互作用的关键结构域,且HTNV NP与EGFR的互作不依赖于其RNA结合功能域。上述结果表明EGFR可能通过其激酶区域与HTNV NP蛋白互作进而影响HTNV复制。综上所述,本研究发现EGFR促进HTNV复制;除了参与HTNV入侵外,EGFR主要依赖其激酶活性促进HTNV基因组转录与复制;并且揭示了HTNV NP与EGFR存在相互作用。这对揭示汉滩病毒感染的机制起到启示作用,也为治疗HFRS提供新靶点。