研究背景和目的:肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)起源于肾小管上皮细胞,是肾癌中最常见的一种病理分型,约占所有肾癌组织学分型的70%。约一半的ccRCC患者发生转移性扩散,转移后的ccRCC患者的5年生存率仅为10%。发生转移的ccRCC对放化疗具有抵抗性,临床以小分子靶向药物治疗为主。E2F7是转录因子E2F家族成员中非经典的转录抑制子,在细胞周期进程和DNA损伤反应中发挥着重要的作用。E2F7对肿瘤的发生发展具有双向调控作用。例如,有研究表明,E2F7在结直肠癌和胶质母细胞Roxadustat供应商瘤等癌症中促进肿瘤恶性转化,而在头颈部鳞状细胞癌和膀胱癌中抑制肿瘤的进展。生物信息学分析显示E2F7的m RNA水平在ccRCC肿瘤组织中升高,目前E2F7在ccRCC中的具体作用尚不明确。B-MYB编码一种转录因子,与E2F家族共同调控细胞周期进程,在细胞周期S期激活许多基因的表达,其表达的变化与生长停滞、凋亡和衰老有关,在大多数肿瘤中起促癌作用。同样的,B-MYB对ccRCC的具体影响尚不明确。有研究表明经典的转录激活子E2F1在ccRCC中上调,促进ccRCC细胞的增殖、侵袭和迁移。在肝癌中,E2F1转录激活B-MYB的表达进而促进肝癌的恶性进展。生物信息学分析显示E2F7与B-MYB的m RNA水平在ccRCC中上调且对应不良预后。基于E2F7和B-MYB在ccRCC中的生物信息学分析、E2F家族成员和B-MYB在细胞周期中的密切联系以及肝癌中E2F1对B-MYB转录调控的证据,我们推测转录因子E2F7可通过转录调控B-MYB在ccRCC发生发展过程中起着重要作用。本文意在探究E2F7与B-MYB各自在ccRCC中对细胞增殖和凋亡的影响以及它们二者之间的调控关系。研究方法:1、通过TCGA数据库的在线分析工具UCSC XENA,分析E2F7与B-MYB在ccRCC中m RNA的差异表达及二者之间表达的相关性和预后。2、使用逆转录定量聚合酶链反应(Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)对16对临床样本的E2F7和B-MYB的m RNA水平进行检测。3、使用蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)检测35对临床样本中E2F7的蛋白水平,使用免疫组织化学染色(Immunohistochemical staining,IHC)法对13对临床样本E2F7和B-MYB的蛋白水平进行检测。4、通过RT-q PCR和WB检测786-O、769P、CAKI-1和CAKI-2细胞中E2F7和B-MYB的m RNA和蛋白水平。5、使用慢病毒转染技术构建不同的E2F7或B-MYB稳定敲减或过表达的ccRCC细胞系,并利用WB技术检测E2F7或B-MYB的蛋白水平来验证基因敲减或过表达效率。6、通过细胞计数法、集落形成实验和流式细胞周期实验技术检测干预E2F7和B-MYB后ccRCC细胞的增殖能力。7、通过TUNEL(Terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP nick-end labeling)实验技术检测干预E2F7和B-MYB后ccRCC细胞的凋亡能力。8、通过小干扰RNA技术(si-RNA)在CAKI-1细胞中瞬时敲减E2F7,并利用RT-q PCR技术检测瞬时敲减E2F7后B-MYB的m RNA水平的变化。9、利用染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)技术检测E2F7是否直接与B-MYB启动子区域结合。10、利用双荧光素酶报告基因实验(DCB-839生产商ual luciferase reNervous and immune system communicationporter gene assay)技术鉴定ccRCC细胞中E2F7对B-MYB的直接转录调控作用。11、通过慢病毒转染技术构建CAKI-1 sh-NC1+sh-NC2、sh-E2F7+sh-NC2、sh-NC1+sh-B-MYB及sh-E2F7+sh-B-MYB稳定敲减细胞系。12、通过细胞计数法、集落形成实验检测上述细胞敲减E2F7和B-MYB后细胞增殖能力变化。13、通过TUNEL实验技术检测共转敲减E2F7和B-MYB后细胞凋亡能力的变化。14、在ccRCC细胞中瞬时过表达E2F7,并分别利用WB和RT-q PCR技术检测E2F7和B-MYB在细胞核与细胞质中的蛋白和m RNA水平。研究结果:1、生物信息学分析显示,正常组织相比,E2F7和B-MYB在ccRCC肿瘤组织中高表达。2、E2F7和B-MYB的高表达与ccRCC不良预后(包括总生存率和疾病特异性生存率)呈正相关。3、对比非肿瘤样本,E2F7和BMYB在ccRCC肿瘤样本中高表达,且二者的mRNA水平呈正相关。4、稳定敲减E2F7促进786-O和CAKI-1细胞的增殖,稳定过表达E2F7抑制CAKI-2细胞的增殖;5、稳定敲减E2F7抑制CAKI-1细胞的凋亡,稳定过表达E2F7促进CAKI-2细胞的凋亡;6、稳定敲减B-MYB抑制786-O和CAKI-1细胞的增殖,稳定过表达B-MYB促进769P和CAKI-2细胞的增殖。7、稳定敲减B-MYB促进CAKI-1细胞的凋亡,稳定过表达B-MYB抑制CAKI-2细胞的凋亡;8、E2F7对B-MYB的m RNA和蛋白水平呈负向调控。9、E2F7直接与B-MYB的启动子结合并转录抑制其表达。10、E2F7在ccRCC肿瘤组织中核质分布比例低于癌旁。研究结论:1、E2F7和B-MYB在ccRCC组织中高表达,且二者呈正相关。2、E2F7可抑制ccRCC细胞的增殖,促进ccRCC细胞的凋亡。3、B-MYB可促进ccRCC细胞的增殖,抑制ccRCC细胞的凋亡。4、E2F7可通过转录抑制BMYB抑制ccRCC细胞的增殖和促进ccRCC细胞的凋亡。