研究背景与目的:结肠癌是一种对人类危害性大且较为常见的恶性程度高的胃肠道肿瘤之一,随着人们饮食水平的提高,结肠癌的发病风险越来越大。目前,其治疗方法仍然以根治性手术治疗为主,化疗为辅。术后辅助化疗能够降低结肠癌转移和复发的风险,但随着化疗药物耐药的产生,旧药已经越来越不能满足当前的治疗需求,因此需要寻求新的化疗药物以改善患者预后。在结肠癌的所有目前已知的各种致病因素中,已经证实慢性炎症与结肠癌关系更为紧密,多数结肠癌患者的肿瘤组织中存在着炎症浸润的情况。细胞焦亡是一种继细胞凋亡、细胞自噬以来被发现的一种新的程序性细胞死亡方式,其特点是细胞发生肿胀、从细胞膜中冒出大气泡并伴随炎症因子的释放,诱发级联炎症反应。课题组的前期实验发现,新型药物DS6051b处理AZD9291供应商可以引起结肠癌细胞发生Caspase-3/GSDME介导的细胞焦亡。然而,具体机制尚不清楚,DS6051b对结肠癌细胞的生长复制有无明显的抑制作用也有待进一步验证。因此,本论文通过细胞实验,以及利用基因干预等研究手段,阐明DS6051b抑制结肠癌细胞并诱导其焦亡的具体作用分子机制。材料与方法:1.筛选和分析对结肠癌细胞有杀伤作用的药物DS6051b从细胞焦亡化合物库中的39种小分子化合物中,通过使用细胞活性检测试剂CCK-8,进行初筛和2次筛选,为分析筛选结果,采用转录组测序对课题组购买的结肠癌细胞进行融合基因检测。在DS6051b处理后,通过CCK-8评价DS6051b不同时间对结肠癌细胞HCT116和Lo Vo的损伤作用。结晶紫染色检测细胞增殖情况。2.DS6051b诱导结肠癌细胞发生焦亡DS6051b浓度5u M处理结肠癌细胞HCT116和Lo Vo 24h后,分别通过显微镜和扫描电镜观察细胞的形态学变化。通过流式细胞术实验检测HCT116和Lo Vo细胞的Annexin V-PE和7-AAD双阳性比例;通过TUNEL实验和乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)细胞毒性释放试验评价DS6051b对HCT116和Lo Vo细胞的损伤作用。通过免疫印迹(Western Blot,WB)检测细胞焦亡相关蛋白Caspase-3、PARP、GSDME-N的变化情况;采用Caspase-3特异性抑制剂ZVAD预处理HCT116和Lo Vo细胞1h,显微镜观察细胞形态学变化,CCK-8评价DS6051b及抑制剂对HCT116和Lo Vo结肠癌细胞的损伤作用,LDH细胞毒性释放试验评价DS6051b及其抑制剂对HCT116和Lo Vo结肠癌细胞的损伤作用。3.DS6051b通过SRC介导结肠癌细胞焦亡分别通过数据库和文献筛选MK-2206溶解度出DS6051b可能的靶标和结肠癌相关靶标,取交集后作PPI蛋白互作网络,预测DS6051b最可能的作用于结肠癌的靶标SRC。免疫印迹(Western Blot,WB)检测SRC表达情况,检测AKT/m TOR磷酸化的情况。通过病毒质粒转染过表达SRC,在DS6051b处理24h后,再次WB检测SRC以及AKT/m TOR磷酸化的表达情况。细胞活性检测试剂CCK-8评价DS6051b及SRC过表达对HCT116和Lo Vo结肠癌细胞的损伤作用和乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)细胞毒性释放试验评价DS6051b及SRC过表达对HCT116和Lo Vo结肠癌细胞的损伤作用,以及通过流式细胞术实验检测DS6051b及SRC过表达HCT116和Lo Vo细胞的Annexin V-PE和7-AAD双阳性比例;免疫印迹(Western Blot,WB)检测细胞焦亡相关蛋白Caspase-3、PARP、GSDME-N等的变化情况。结果:1.筛选出抑制结肠癌细胞生存效果最佳的小分子化合物DS6051b,DS6051b明显抑制结肠癌细胞增殖。通过对39种小分子进行初次筛选,筛选出5种抑制率均大于70%的小分子化合物,针对这5种小分子化合物进行二次筛选,筛选出针对2种结肠癌细胞抑制率均大于50%的药物,即DS6051b。具文献报道,该小分子对发生ROS1/NTRK基因重排肿瘤有疗效,于是对组中所用结肠癌细胞进行转录组测序,发现并无ROS1/NTRK基因重排。HCT116和Lo Vo细胞分别经1.25、2.5、5、10、20u M浓度处理后24h,细胞活性随DS6051b浓度增长而明显降低。2.DS6051b诱导结肠癌细胞发生Caspase-3/GSDME介导的细胞焦亡DS6051b分别处理HCT116和Lo Vo结肠癌细胞24h后,在显微镜下观察,与对照组相比,细胞数量减少、发生出泡等形态学变化,进一步扫描电镜下观察,与对照组相比,细胞出现孔洞及出泡等变化。流式细胞检测也显示增加了Annexin VPE和7-AAD双阳性细胞数量。WB检测发现DS6051b处理后同时上调了CleavedCaspase-3、GSDME-N、PARP-CL的表达,并且两种细胞株的LDH毒性释放均增加。为了验证DS6051b处理后细胞是否通过Caspase-3/GSDME介导的细胞焦亡,通过Z-VAD预处理HCT116和Lo Vo细胞1h,DS6051b分别处理HCT116和Lo Vo结肠癌细胞24h后,显微镜观察,细胞焦亡情况明显逆转;同时逆转了上调的CleavHip flexion biomechanicsed-Caspase-3、GSDME-N、PARP-CL的表达;HCT116细胞CCK8显示,与DS6051b处理组相比,抑制剂处理组的细胞活性明显回升(p<0.01),Lo Vo细胞CCK8显示,与DS6051b处理组相比,抑制剂处理组的细胞活性同样明显回升(p<0.05);LDH毒性释放实验表明,在HCT116细胞中,与DS6051b处理组相比,LDH毒性释放减少(p<0.001),Lo Vo细胞中LDH毒性释放也相对明显减少(p<0.05)。3.DS6051b抑制SRC/AKT/m TOR磷酸化途径介导结肠癌细胞焦亡,从而导致结肠癌细胞损伤。通过从Swiss Target Prediction网站中获取100个DS6051b可能的作用靶标(表S1),文献中获取DS6051b有效作用激酶靶标202个(表S2),两者求交集得28个DS6051b潜在靶标,再从Dis Ge NET、Genecard、OMIM、uniport数据库中共收集了2388个已知的结肠癌相关基因(表S3),将获取的DS6051b潜在靶标与结肠癌相关靶标交集之后得到10个待选目标,10个待选靶标进行PPI网络构建分析之后,确定SRC作为DS6051b作用于结肠癌的最可能的靶标。药物DS6051b处理HCT116和Lo Vo后,SRC的表达都受到明显抑制,且AKT、m TOR磷酸化也显著减弱。通过病毒质粒转染过表达SRC后,显示逆转了被抑制的SRC以及AKT、m TOR的磷酸化,同时逆转了上调的焦亡相关因子Cleaved-Caspase-3、GSDMEN、PARP-CL的表达,并且逆转了Annexin V-PE和7-AAD双阳性比例。与DS6051b处理组相比,SRC过表达组LDH毒性释放也显著减少(HCT116细胞:p<0.01;Lo Vo细胞:p<0.05)。结论:1.DS6051b抑制结肠癌细胞增殖,抑制率与DS6051b作用浓度呈正相关。2.DS6051b诱导结肠癌细胞发生肿胀、出泡和出现孔隙,并且释放LDH,通过激活Caspase-3裂解GSDME,导致结肠癌细胞发生焦亡;3.DS6051b通过抑制SRC/AKT/m TOR信号通路,激活Caspase-3/GSDME介导的细胞焦亡。