子宫内膜炎是当今动物养殖中最常见的产科疾病之一,主要发生在母畜分娩3周以后,每年因为该疾病的产后爆发对养殖业带来巨大的冲击。该病在反刍动物奶山羊、奶牛最为常见。病畜的正常生理机能往往被破坏,进一步导致妊娠困难甚至丧失繁殖能力,严重者出现死亡。作为最主要的致病因素,病原体的感染在其中发挥重要作用,而化脓隐秘杆菌又是其中的主要致病细菌之一,常与其他细菌混合感染加重畜体病情。由于缺乏切实有效的商品化治疗制剂,造成其在牧场防控上面临着诸多问题。对化脓隐秘杆菌致病机制的研究是开发新型防治药物的关键。细菌的胶原结合蛋白隶属于识别黏附基质分子(MSCRAMM)家族成员,他是细菌一类特殊的表面结构,在细菌初期定植、细胞黏附中发挥重要作用,在细菌生物被膜形成、免疫逃逸、与细胞整合素互作等过程中也有相关研究,是细菌侵染细胞重要的组成部分。在化脓隐秘杆菌中,该家族成员被称作胶原结合蛋白(Collagen-binding protein A,Cbp A),其作为分泌性蛋白存在于菌体外。目前对Cbp A的具体作用机制尚不清楚。深入解析Cbp A在菌体侵染机体组织细胞过程中的作用,对于全面认识该菌致病机制具有重要意义。本研究通过抑制Cbp A在化脓隐秘杆菌中发挥作用,检测Cbp A作用下降时,对化脓隐秘杆菌生长、生物膜形成和其黏附、侵袭山羊子宫内膜上皮细胞(gEECs)的影响;同时构建原核表达载体pET-32a-cbp A,通过BL21表达系统诱导表达出带有His标签的rCbp A,进行镍柱纯化后获得目的蛋白;进一步制备小鼠抗Cbp A多抗,Western Blot验证rCbp A的免疫原性;并使用获得rCbp A来处理gEECs,来检测细胞具体炎症因子的变化,得到的主要结果如下:1.使用肝素抑制化脓隐秘杆菌Cbp A的作用,通过细菌增殖初期肝素处理组与未处理组的CFU对比及细菌生长曲线的制作,发现抑制Cbp A对于细菌的自然情况的生长扩增没selleck IACS-10759有显著的影响(p>0.05);使用结晶紫染色法,对于抑制Cbp A与未处理组的对比,发现Cbp A抑制后生物膜形成明显减慢(p<0.05);使用CCK-8和普通光学显微镜形态学观察,确定细菌在MOI为100及以下时,对于gEECs不会有显著的活力影响(p>0.05);通过CFU计数和细胞免疫荧技术,发现肝素抑制Cbp A作用后,菌体对gEECs的黏附、侵袭出现显著的下降(p<0.05),对胞内生存无显著影响(p>0.05),但会使初始进入胞内菌体数量降低;使用q PCR技术,发现肝素Medicines information抑制Cbp A后,gEECs的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8以及三天内质网应激的关键通路因子GRP78、ATF6、IRE1α、PERK的显著降低(p<0.05)。2.PCR扩增目Vorinostat体外的基因cbp A,得到分子量3378 bp大小的目的基因并测序正确,构建原核表达载体pET-32a-cbp A,通过BL21大肠肝菌原核蛋白表达系统诱导表达rCbp A,使用镍柱纯化;rCbp A免疫小鼠,ELISA检测抗rCbp A多抗血清效价,达到1:10~6,Western Blot验证在对应大小蛋白Marker出现特异性条带,证实rCbp A良好的免疫原性;使用纯化后rCbp A处理gEECs,发现对细胞活力无显著影响(p>0.05),进一步使用50μg/m L的rCbp A处理gEECs,发现细胞相关炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6没有显著变化(p>0.05)。综上所述,本试验表明Cbp A的抑制或者缺失对于化脓隐秘杆菌自身生长扩增不会造成影响,但会降低生物膜的形成速率,降低菌体对于gEECs的黏附、侵袭能力,同时显著降低其致炎和内质网应激作用;成功制备重组rCbp A并验证免疫原性,rCbp A单独作用时不会引发gEECs的炎性作用,但与其他毒力因子混合作用以及在免疫逃避和整合素中具体发挥作用有待进一步研究。以上研究为揭示化脓隐秘杆菌引发具体子宫内膜炎的机制奠定一定基础。