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背景在辅助生殖过程中,成功进行体外受精(In vitro fertilization,IVF)的成熟卵母细胞在体外培养过程中,分裂至2～8细胞阶段时分裂停止不再继续发育形成可移植囊胚的现象称为早期胚胎发育阻滞(Early embryonic arrest,EEA),该现象给人类辅助生殖技术带来巨大挑战。环境因素是目前已知的对生殖发育具有重要影响作用的因素之一,因此,从环境因素视角深入探索EEA的风险因素,以提高不孕症患者的胚胎质量,具有重要科学意义。目的本研究基于病例对照研究,分析进行IVF周期的不孕症妇女外周血中砷(Arsenic,As)、汞(Mercury,Hg)、铅(Lead,Pb)、钡(Barium,Ba)联合暴露水平与EEA风险之间的关联,并筛选哪种或哪些金属元素在此关联中发挥主导作用;探索与EEA风险关联具有显著统计学意义的线粒体DNA非编码区(Mitochondrial DNA displacement loop,mt DNA D-loop)的基因多态性位点,并分析其与EEA风险的关联强度;评估筛选出的mt DNA基因位点多态性在不孕症妇女有害金属元素暴露与EEA风险关联之间是否存在中介效应;评估筛选出的mt DNA基因位点多态性与有害金属元素暴露之间是否存在交互作用。方法本研究采用非匹配病例对照研究设计,研究对象均为2017年6月～2020年3月就诊于安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心的不孕症妇女:以IVF新鲜周期(取卵周期)发生EEA的不孕症妇女作为病例,共纳入74人(123个IVF新鲜周期);以IVF新鲜周期(取卵周期)优质囊胚率≥70%的不孕症妇女作为对照,共纳入157人(180个IVF新鲜周期);纳入时确保两组不孕症妇女年龄与体重指数的差异无显著统计学意义。研究对象的人口统计学特征和临床信息均从该生殖医学中心病案系统收集。采用电感耦合等离子体质谱仪测定两组不孕症妇女首次进入临床新鲜周期时取卵当日采集的外周血中As、Hg、Pb与Ba四种金属元素的暴露水平;使用聚合酶链式反应扩增与测序检测mt DNA D-loop区基因多态性位点。采用贝叶斯核回归方程(Bayesian kernel machine regression,BKMR)分析四种金属元素联合暴露水平与EEA风险之间的关联,并筛选哪种或哪些金属元素在此关联中发挥主导作用;采用广义估计方程模型(Generalized estimating equation,GEE)分析筛选出的金属元素暴露水平与EEA风险及卵子发生和胚胎发育进程相关指标的关联强度;采用χ~2检验筛选与EEA风险关联具有显著统计学意义的mt DNA D-loop区基因多态性位点,并采用GEE模型分析这些mt DNA基因位点多态性与EEA风险的关联强度;采用中介效应模型评估筛选出的mt DNA基因位点多态性在不孕症妇女有害金LBH589配制属元素暴露与EEA风险关联之间是否存在中介效应;采用GEE模型分析筛选出有害金属元素暴露与mt DNA基因多态性位点的交互作用与EEA风险的关联强度并采用Andersson等人编制的Excel计算器计算相加交互作用的超额相对危险度(Relative excess risk due to interaction,RERI),相加交互作用的比例(Attributable proportion due to interaction,AP)和交互作用指数(Synergy index,S)的估计值及其95%置信区间(Confidence interval,CI)。结果病例组不孕症妇女外周血中As、Hg、Pb和Ba浓度的几何均数(Geometric mean,GM)分别为1.35μg/L、1.51μg/L、23.45μg/L、34.15μg/L,其中病例组不孕症妇女外周血Ba浓度明显高于对照组不孕症妇女(P=0.009)。BKMR结果显示,Ba和Hg与EEA风险呈正相关,As和Pb与EEA风险呈负相关;As、Hg、Pb和Ba的后验概率(Posterior inclusion probabilities,PIP)分别为0.5902、0.6374、0.5548、0.9322,其中Ba的PIP值最高,故Ba可能在四种金属元素联合暴露中发挥主导作用。进一步分析金属元素Ba与EEA风险的关联,与Ba低暴露水平组(<13.36mg/L)不孕症妇女相比,中暴露组(13.36～46.29μg/L)和高暴露组(≥46.29mg/L)不孕症妇女EEA风险显著增加,调整协变量后的比值比(Odds ratio,ORs)及其95%置信区间(Confidence interval,CI)分别为2.61(1.27,5.36)和3.88(1.68,8.95)(P trend=0.005);进一步分析Ba暴露水平与不孕症妇女卵子发生和胚胎发育进程相关指标的关联时,我们发现在调整协变量前后,Ba暴露水平与上述指标均呈负相关,关联均具有显著统计学意义。在检测出的268个mt DNA D-loop区基因多态性位点中,在两组不孕症妇女中,突变频率>10%的位点有27个,采用c~2检验分析突变频率>10%的mt DNA基因位点多态性在两组不孕症妇女中的分布差异并对其所得P值进行错误发现率(False discovery rate,FDR)校正,仅发现mt DNA 16519这一基因位点的多态性(T16519T vs.T16519C)在两组不孕症妇女间的分布差异具有显著统计学意义(P_(FDR)=0.027)。与携带野生型mt DNA 16519基因(T16519T)的不孕症妇女相比,携带突变型mt DNA 16519基因(T16519C)的不孕症妇女EEA风险显著增加(OR(95%CI):3.30(1.58,6.79))。进行一系列敏感性分析后,上述分析结果依旧稳健。中介效应模型分析结果显示,在本研究人群中,调Fer-1体外整协变chemical pathology量后,mt DNA 16519基因多态性在不孕症妇女外周血Ba暴露水平与EEA风险之间的关联中无中介效应(间接效应估计值和95%CI为0.002(0.000,0.017)。交互作用结果显示,与Ba低暴露水平且携带野生型16519基因(Ba≤21.74mg/L&T16519T)的不孕症妇女相比,Ba高暴露水平且携带突变型16519基因(Ba>21.74mg/L&T16519C)不孕症妇女EEA风险的调整OR(95%CI)为8.83(2.93,26.65)(P<0.001),提示二者有相乘交互作用;同时mt DNA 16519基因多态性位点与Ba暴露的相加交互作用相关指标REPI、AP、S的估计值及其95%CI分别为4.07(-2.70,10.84)、0.46(-0.02,0.95)、2.08(0.68,6.37),结果提示二者无相加交互作用。结论本研究发现不孕症妇女外周血中As、Hg、Pb和Ba四种金属元素联合暴露与不孕症妇女EEA风险呈正相关,且Ba元素在联合暴露中可能发挥主导作用;Ba暴露水平与卵子发生和胚胎发育进程相关指标均存在显著的负向关联。与携带野生型mt DNA 16519基因(T16519T)的不孕症妇女相比,携带突变型mt DNA16519基因(T16519C)的不孕症妇女EEA风险显著增加,但调整协变量后,mt DNA 16519基因多态性在不孕症妇女Ba暴露与EEA风险关联之间在本研究人群中未发现中介效应;在上述关联中,Ba暴露水平与mt DNA 16519基因多态性间存在相乘交互作用,无相加交互作用。

目的:基于网络药理学及分子对接方法探讨丹参有效成分治疗冠心病和脑卒中“异病同治”的作用机制及关键靶点。方法:通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、DrugBank等数据库筛选丹参治疗冠心病及脑卒中的潜在靶点，并通过Metascape在线平台进行靶点蛋白-蛋白相互作用(PPI)、基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析，使用Cytoscape 3.9.1构建活性成分-关键靶点-核心通路网络，筛选出核心成分。采用分子对MAPK抑制剂接模拟核心成分与关键靶点的结合程度。结果:筛选丹参治疗冠心病与脑卒中“异病同治”的潜在靶点52个，主要富集于糖基化终末产物/糖基化终末产物受体(AGE/RAGE)、血小板激活、脂质与动脉粥样硬化、流体剪应力与动脉粥样硬化等通路。核心药效成分与Coroners and medical examiners磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、一氧化氮合酶(NOS3,eNOS)、B淋巴细胞瘤相关蛋白-2(Bcl-2)、环氧合酶2(PTGS2)、整合素亚GSI-IX试剂基α2b(ITGA2B)、基质金属蛋白酶9(MMP9)等靶点结合稳定。结论:丹参“异病同治”冠心病与脑卒中主要通过抗血小板活化与聚集、保护心脑血管细胞、稳定斑块、减轻炎症等机制改善动脉粥样硬化，并存在靶点竞争及协同疗效的潜在可能。

【目的】研究宣威肺癌高发地区广泛使用的烟煤中的铁元素迁移富集路线,探索是否存在“烟煤燃烧—含铁煤烟尘吸入—体内铁过载—细胞铁死亡(ROS堆积)—肺癌发生”的致病过程,为该地区高发肺癌防治提供参考。【方法】1.X-ray能谱分析宣威地区原煤燃烧释放入室内空气悬浮颗粒物表面是否富集铁元素。2.通过普鲁士蓝染色,证实宣威地区女性肺癌患者肺组织、纵隔淋巴结是否存在含铁(Fe)颗粒沉积现象。3.Western-Blot检测9例宣威地区农村女性获悉更多肺腺癌患者和9例非宣威地区的女性肺腺癌患者术后肺组织中铁转运相关蛋白转铁蛋白1(TransferrinGefitinib体外1,Tf1)、转铁蛋白2(Transferrin2,Tf2)和细胞铁死亡通路核心基因谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione PeroxidasRNA biologye 4,GPX4)蛋白含量。4.收集制作肺癌组织、癌旁组织、正常肺组织透射电镜观察切片。通过透射电镜观察细胞线粒体形态,寻找与细胞铁死亡发生相关证据。5.制作100μg/m L煤烟尘悬液,将BEAS-2B细胞暴露于煤烟尘悬液;将BEAS-2B细胞暴露于100μg/m L 20nm三氧化二铁,观察和检测比较两种条件下细胞形态的变化及活性氧(ROS)水平。【结果】1.X-ray能谱分析发现,铁元素以纳米氧化亚铁(Fe~(2+))颗粒物的形式附着于烟煤燃烧释放入室内空气中的二氧化硅颗粒物表面。2.通过普鲁士蓝染色,发现宣威地区农村女性肺癌患者纵隔淋巴结内有大量含铁(Fe)颗粒沉积。3.通过Western-Blot技术检测肺组织中Tf1和Tf2含量,发现Tf1蛋白含量宣威组高于非宣威组(P<0.01),Tf2蛋白含量宣威组则低于非宣威组(P<0.01)。GPx4蛋白含量宣威组低于非宣威组,但无统计学差异(P>0.05)。4.透射电镜观察组织切片,发现癌细胞和癌旁组织正常细胞中存在细胞“铁死亡”现象(细胞线粒体变小,双层膜密度增加)。5.暴露100μg/m L煤烟尘悬液24h(A)、48h(B)和72h(C)小时后的BEAS-2B细胞形态变化与暴露100μg/m L 20nm三氧化二铁24h(A)、48h(B)和72h(C)小时后的BEAS-2B细胞形态变化趋势一致,活性氧水平逐渐升高。【结论】初步证实,宣威地区广泛使用烟煤中的铁元素存在“烟煤燃烧—室内空气悬浮颗粒物—吸入肺部并在肺内沉积”的迁移富集路线;宣威地区农村女性肺癌高发可能存在“含铁煤烟尘暴露—体内铁过载—细胞铁死亡—ROS堆积—诱导肺癌发生”的致病途径。

背景:牙周炎是牙周支持组织的炎症性、破坏性疾病,由牙菌斑引起的牙龈的免疫性炎症反应,导致牙周附着结构的破坏。严重的牙周炎会使患牙松动、移位甚至丧失。牙周炎在全球范围均是成人牙齿丧失的首位原因。目前对于牙周病的治疗方法主要有基础治疗、手术治疗以及药物治疗,但是都无法治愈。中药作为牙周病治疗中调节宿主免疫反应的一个辅助方法,有待于进一步的研究和发掘。目的:通过网络药理学分析,筛选苗药固齿方(MYGCF)及牙周病共同作用靶点,探究苗药固齿方在体外对于成骨细胞与破骨细胞增殖、分化以及对二者共同作用靶点RXRα表达的影响,探究苗药固齿方在体内对于大鼠牙周炎骨修复的效果,为将中药复方制剂用于临床上治疗口腔骨破坏疾病提供实验依据。方法:1.通过网络药理学分析,筛选苗药固齿方及牙周病共同作用靶点。2.煎煮及制备苗药固齿方药液、筛选苗药固齿方作用于细胞的最佳药物浓度,建立苗药固齿方作用于LPS介导下的成骨细胞和破骨细胞的炎症微环境的体外模型,通过CCK-8、Real-time q PCR、Western Blot、ALP染色、茜素红染色、TRAP染色,研究苗药固齿方对成骨细胞、破骨细胞增殖分化的作用。3.收集临床慢性牙周炎患者的牙周组织样本,通过Real-selleck合成time q PCR、Western Blot、免疫组织化学染色,检测苗药固齿方及牙周病共同作用靶点RXRα在牙周炎组织中的表达情况。4.建立大鼠牙周炎模型,通过Micro-CT、HE、IHC染色等实验,研究苗药固齿方对于骨修复的作用及其对机体的生物安全性。结果:1.网络药理学分析苗药固齿方主要有效成分以及筛选苗药固齿方与牙周炎的相交靶点苗药固齿方治疗牙周炎的核心活性成分为槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素等;关键靶点有PTGS2、PTGS1、RXRα、RELA、CASP3、PIK3CG、AKT1等;关键信号通路有AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路等;其功能主要为调节炎症反应及骨破坏等。2.苗药固齿方对成骨细胞、破骨细胞增殖分化的作用研究(1)苗药固齿方药煎液的制备及最适药物浓度筛查通过煎煮法成功制备出苗药固齿方药煎液,CCK-8结果显示苗药固齿方在1×10~(-1)g/ml时对成骨细胞、破骨细胞增殖呈现明显的抑制作用(P<0.05),在1×10~(-4)g/ml时对成骨细胞、破骨细胞增殖活性没有影响。(2)苗药固齿方作用下对成骨细胞、破骨细胞分化的影响1)成骨诱导液、成骨诱导液+苗药固齿方药液作用于MC3T3-E1细胞后,ALP染色结果显示,成骨诱导液+苗药固齿方组的胞浆内呈红色且较成骨诱导液组颜色深。茜素红结果显示,成骨诱导液+苗药固齿方组有片状的深红色钙化结节且明显多于成骨诱导液组。2)RANKL诱导液、RANKL诱导液和苗药固齿方药液作用于RAW264.7细胞后,通过光学显微镜观察发现,RANKL组出现较多的多核巨细胞,胞体较大,边缘不整齐,周围有毛刷状边缘和褶皱,有伪足,含有三个或三个以上的细胞核。RANKL和苗药固齿方组细胞形态呈现不规则形,大致呈现类圆形,细胞核数量多数为单核或者双核,多核巨细胞的数量明显低于RANKL组。TRAP染色结果显示Digital PCR Systems,RANKL组破骨细胞的褶皱和胞浆内TRAP阳性颗粒清晰可见,TRAP阳性颗粒数量明显多于RANKL和苗药固齿方组。(3)在LPS介导的炎症微环境中,苗药固齿方对成骨细胞、破骨细胞中RXRα以及成骨、破骨相关因子表达的影响1)LPS、苗药固齿方作用于成骨细胞后,Real-time q PCR结果显示,苗药固齿方组RXRα、ALP基因水平表达较空白对照组升高(P<0.05),LPS组RXRα、ALP基因水平表达较空白对照组降低(P<0.05),LPS+苗药固齿方组RXRα、ALP基因水平表达较LPS组升高(P<0.05)。Western Blot结果显示趋势同Real-time q PCR趋势相一致。2)LPS、苗药固齿方作用于破骨细胞后,Real-time q PCR结果显示,苗药固齿方组RXRα基因水平表达较空白对照组升高,Acp5基因水平表达较空白对照组降低(P<0.05),LPS组RXRα基因水平表达较空白对照组降低,Acp5基因水平表达较空白对照组升高(P<0.05),LPS和苗药固齿方组RXRα基因水平表达较LPS组升高,Acp5基因水平表达较LPS组降低(P<0.05)。Western Blot结果显示趋势同Real-time q PCR趋势相一致。3.RXRα在临床慢性牙周炎患者牙周组织中的表达Real-time q PCR结果显示,RXRα基因水平在6例慢性牙周炎临床样本中的表达低于6例健康牙周临床样本(P<0.0001)。Western Blot结果显示RXRα蛋白水平在6例慢性牙周炎临床样本中的表达低于6例健康牙周临床样本(P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示RXRα主要表达于细胞核内,在6例慢性牙周炎临床样本中的表达低于6例健康牙周临床样本(P<0.05)。4.苗药固齿方在大鼠牙周炎中对骨修复的影响(1)上颌骨的大体观显示,通过丝线和正畸结扎丝成功构建大鼠牙周炎模型。(2)龈沟探诊深度结果显示,空白对照组、牙周炎组龈沟探诊深度无明显变化,苗药固齿方组、甲硝唑组,均明显小于牙周炎组。表明苗药固齿方可以改善牙周炎的龈沟探诊深度。(3)Micro-CT 3D重建结果显示,空白组上颌第一、第二磨牙间的牙槽骨形态完整连续;牙周炎组上颌第一、第二磨牙间的牙槽骨形态呈现“深凹坑”状;苗药固齿方组上颌第一、第二磨牙间的牙槽骨形态略有降低寻找更多;甲硝唑组上颌第一、第二磨牙间的牙槽骨形态较为连续,呈现“浅凹坑”状。HE染色结果显示,苗药固齿方可以改善大鼠牙周炎的牙槽骨骨破坏,且效果优于甲硝唑。IHC染色结果显示苗药固齿方可以在体内促进RXRα以及OCN的表达以及抑制TNFα的表达。(4)大鼠肝脏、肾脏的HE染色结果显示,空白对照组、牙周炎组、苗药固齿方组、甲硝唑组的肝、肾形态表现一致,无任何器质性病变的发生。在给药期间大鼠体重均稳步提高,各组之间亦无明显变化,说明苗药固齿方在体内具有较好的生物相容性。结论:1.苗药固齿方的有效药物活性成分主要有五种,分别为槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、金合欢素。2.苗药固齿方与牙周炎主要相交靶点之一为RXRα,其有效药物活性成分均能与RXRα进行有效的结合。3.苗药固齿方通过促进RXRα和成骨相关因子的表达促进成骨细胞增殖分化,通过抑制破骨相关因子的表达从而抑制破骨细胞生成。4.苗药固齿方可促进牙周炎大鼠的牙槽骨骨修复,并具有较好的生物相容性。

为了开发紫球藻藻资源，利用非洲大蜗牛(Lissachatina fulica)消化道混合酶酶解紫球藻胞外多糖(exopolysaccharide from Porphyridium cruentum,EPC)后以离子交换层析法对其酶解物进行分离纯化，并通过红外光谱法初步鉴定各纯化组分的结构，最后对其纯化前后的抗氧化活性进行研究.结果表明：EPC酶解物经两次分级纯化后获得8个纯度较高的多糖组分，其总糖和硫酸基含量均在30%和3%以获悉更多上.8个多糖组分中均含有多糖的特征吸收峰，多糖结构为吡喃糖，糖链中的糖苷键为β-构型，并携带硫酸基团.EPC酶解物纯化前后抗氧化活性与总糖浓度呈正相关，纯化后的EPC_Ⅱ对·OH、DPPH·、ABTS·~+和O_2~-·4种自由基清除率的IC_(50)值分别为0.032、0.439、0.311、4.091 mg·mL~(-1),相比于EPC酶解物和EPC_Ⅰ其清除能力genetic swamping显著提高Pexidartinib核磁.EPC_Ⅱ纯化后EPC_Ⅱ-Q_Ⅰ的ORAC值高达1 523.98μmol·g~(-1),分别是EPC酶解物、EPC_Ⅰ和EPC_Ⅱ的3.21、14.62和2.69倍.EPC酶解物经分级纯化后可获得高抗氧化活性的多糖组分.

目的 评价问题解决型品管圈活动在规范急性缺血性脑卒中（AIS）患者血管内治疗术后抗血小板药物使用中的应用效果。方法 建立品管圈，并将medical device活动主题确定为“缩短AIS患者血管内治疗后抗血小板药物序贯治疗时间”。选择2019年1月至2020年12月（实施品管圈活动前）121例于我中心行机械取栓桥接抗血小板药物序贯治疗的AIS患者，分析影响抗血小板药物序贯治疗时间不达标的主要因素，拟定现状改善品管圈干预措施。另外选择2021年1月至12月（实施品管圈活动后）在我中心行相同治疗的95例AIS患者CH-223191配制，实施问题解决型品管圈干预措施，评价和分析应用效果。结果 实施品管圈活动前后两组患者的年龄、性别、入院时美国国立卫生研究院卒中量表评分、发病至血管再通时间差异均无统计学意义（P均>0.05）。实施品管圈活动前，药物中断时间为133(110,175)min，序贯治selleckchem AY-22989疗时间为367(183,496)min，序贯治疗时间不达标率为45.5%(55/121)。根据柏拉图80/20法则，造成序贯治疗时间不达标的主要原因为等待外出CT检查时间长（36.4%,20/55）、等待CT判读结果时间>60 min(27.3%,15/55)、护士不知晓患者口服药物时间（20.0%,11/55）。实施品管圈活动后，药物中断时间为38(25,71)min，序贯治疗时间为257(210,298)min，序贯治疗时间不达标率为7.4%(7/95)，与实施品管圈活动前比较差异均有统计学意义（P均<0.001）。实施品管圈活动前后两组分别有3、2例患者在序贯治疗7 d内出现症状性颅内出血，差异无统计学意义（P>0.05）；两组患者序贯治疗7 d内均无消化道出血发生。结论 应用问题解决型品管圈活动能够规范AIS患者机械取栓术后抗血小板药物给药流程，可以缩短患者药物中断时间，精确口服药物桥接时间，提高患者的用药安全性。

为了探讨mi R-542-3p的生物信息学信息及其对未成熟猪睾丸支持细胞的影响,试验通过Ali Baba 2.1和AnimalTFDB 3.0软件预测mi R-542-3p转录因子结合位点(TFBS);并分析mi R-542-3p在不同物种间的保守性;采用CCK-8试剂、ATP试剂盒、流式周期检测试剂盒和实时荧光定量PCR方法探究过表达mi R-542-3p对未成熟猪睾丸支持细胞的影响;利用TargetScan、mi RDB和mi Walk 3种在线软件预测mi R-542-3p靶基因后取交集,并对猪源靶基因进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析;最后利用Cytoscape 3.2. 0软件构建TF-mi R-542-3p-靶基因相互作用网络。结果表明:经预测mi R-542-3p受GATA1、TBP、Sp1、Ap1、SRF等多个转录因子调控,且在多物种间具有高度的保守性;mi R-542-3p可显著或极显著抑制未成熟猪睾丸支持细胞增殖活性(P<0.05或P<0.01),极显著降低细胞内ATP含量(P<0.01),显著或极显著抑制细胞增殖基因和周期基因的相对表达量(P<0.05或P<0.01),进而抑制细胞周期和细胞增殖;转染mi R-542-3p mimic后G1期猪睾丸支持细胞比例显著升高(P<0.05),S期细胞比例极显著降低(P<0.01);共发现7个猪源mi R-542-3p潜在靶基因,mi R-542-3p调控的UBE2E1基因相对表LY294002 IC50达量极显著下降(P<0.01),KCMF1、ILK基因相对表达量显著下降(P<0.05),HIPK3基因相对表达量极显著升高(P<0.01),AP3D1、PLEKHM3基因相AZD6738作用对表达量显著升高(P<0.05),各靶基因主要在激酶活性和结合上发挥作用;mi R-542-3p靶基因主要参与MAPK、cAMP、TGF-β和cGMP-PKG等信号通路;构建的TF-mi R-542-3p-靶基因相互作用网络包含5个转录因子和50个m RNA。说明mi R-542-3p受多种转录因子调控,在多物种间高度保守,能够抑制未成熟猪睾丸支持细胞增殖,并通过调控下游靶基因的表达参ultrasound in pain medicine与MAPK、cAMP和TGF-β等信号通路,从而调控未成熟猪睾丸支持细胞生长。

目的：建立同时测定~(60)Co-γ射线辐照前后发酵虫草菌粉（Cs-4）中棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸的含量的方法，并对5种脂肪酸类成分的稳定性进行考察。方法：采用气相色谱法，色谱柱为DB-WAX毛细管柱（30 m×0.53 mm×0.25μm），程序升温，检测器为氢离子火焰检测器，检测器温度为280℃，进样口温度为270℃，载气为高纯氮气，流速为0.5 mL/min，进样量为1μL，进样分流比为10∶1。通过影响因素试验、加速试验及长期试验考察~(60)Co-γ射线辐照前后发酵虫草菌粉中脂肪酸类成分的稳定性。结果：通过方法学考察，5种脂肪酸类成分在59.68～477.44,23.58～188.61,91.40～594.10,158.72～1 587.20,27.97～279.70μg/mL内线性关系良好（r>selleck化学0.997）；平均加样回收率为97.87%～100.77%,RSD≤3.00%。稳定性考察结果表明，5种脂肪酸类成分均较稳定，含量变化无显著差异。结论：本研究所建方法准确可靠、重复性好，~(60)Co-γ射线辐照灭菌前后发酵虫草菌粉中5种脂肪酸类成分在不同Docetaxel使用方法条件存放后未有明显变化，为发酵Disseminated infection虫草菌粉辐照灭菌方式的选择提供了实验依据。

肝病是世界范围内的重大健康和经济负担,随着其发病率的不断升高,肝病已经成为全球疾病和死亡的主要原因之一。在各种慢性肝病中,随着肝病的进展,肝细胞逐渐失去其强大的再生能力,并走向死亡或者衰老,进而导致肝纤维化,肝纤维化发展为肝硬化,最终可能发展为肝癌。当肝病进展到终末期时,唯一有效的治疗方法是肝移植,但移植后需要终身服用免疫抑制剂,同时供体器官匮乏意味着患者可能会在等到合适的移植器官前死亡。在临床中,确保部分肝切除和部分肝移植患者生存和良好预后的先决条件是肝再生。当部分肝切除或部分肝移植术后肝脏无法有效再生,则会引起严重威胁患者生命安全的小肝综合征。在药物和肝毒性物质等因素导致的急慢性肝损伤患者中,肝细胞有效的增殖同样是患者良好预后的重要保障。因此,建立有效的手段启动肝再生或者修复肝细胞受损的再生能力具有重要的临床意义。众所周知,肝脏具有卓越的再生能力,啮齿动物三分之二肝切除模型首次向人们展示了这种强大的再生能力。正常成体肝脏中的肝细胞大部分处于G0期,很少出现细胞分裂,然而在部分肝切除术后,约95%的肝细胞迅速重新进入细胞周期,残存的肝脏在1周左右快速恢复至原来大小。肝再生是一个多步骤、多因子、涉及多种信号相互作用精确而有序的调控过程。由于肝再生过程的复杂性,许多调控机制仍有待进一步探究。综上,阐明肝再生启动与终止的调控机制,对于阐明众多肝脏疾病(如代谢性肝病、肝硬化、肝癌等)的发病机制及其临床治疗具有极其重要的意义。因此我们尝试通过小分子组合对肝脏稳态进行精准干预,以实现对肝脏原位肝再生精确有效的调控。本课题主要包括四部分研究内容。第一部分是活性分子促进肝脏细胞原位增殖的化学筛选,结合前期的研究基础和损伤后肝再生机理的认识,我们选择转化生长因子β(Transforming growth factor-beta,TGFβ)受体抑制剂、溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)、p38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases,p38 MAPKs)抑制剂、前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)衍生物和Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)激动剂作为基础分子筛选促进肝脏中细胞原位增殖的活性分子及组合。首先是以TGFβ受体抑制剂为基础分子,筛选促进肝脏细胞原位增殖活性分子组合。我们选择以TGFβ受体抑制剂为基础分子联合肝再生过程中另外两条重要信号通路Wnt和肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)/c-Met来尝试启动肝脏中细胞增殖(该调控组合命名为LCD),结果表明抑制TGFβ、同时激活Wnt和HGF/c-Met信号通路并不能有效启动小鼠肝脏细胞的原位增殖程序。鉴于肝再生是多信号通路参与的复杂过程,因此在上述联合调控TGFβ、Wnt和HGF/c-Met信号通路基础上,我们加入了TLR7和TLR8的激动剂小分子化合物Resiquimod,结果表明小分子化合物Resiquimod的加入不能有效启动小鼠肝脏原位细胞的增殖,同时我们继续尝试在上述四分子(TGFβ受体抑制剂、HGF类似物、糖原合成酶激酶(Glycogen Synthase Kinase 3,GSK3)抑制剂以及TLR7和TLR8的激动剂)基础上加入法尼素X受体(Farnesoid X receptors,FXRs)激动剂鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA),结果表明法尼素X受体激动剂的加入也不能有效启动小鼠肝脏原位细胞的增殖。鉴于TLR受体在肝再生启动过程中的重要性以及多样性,我们用另外一种TLR激动剂S替换TLR7和TLR8的激动剂,结果表明TLR激动剂S的加入(即LCDS组合)显著提升了小鼠肝脏中Ki67阳性细胞的比例(6.27%±0.83%),我们推测TLR激动剂S可能在肝再生过程中具有重要的作用。接下来,我们继续以TGFβ受体抑制剂为基础分子分别与TLR激动剂(LS组合)、核受体激动剂(LT和LW组合)以及核因子红细胞2相关因子(Nuclear factor erythroid 2-related factor,Nrf2)激动剂diABZI STING agonist研究购买(LC组合)组合来探究其对于肝脏细胞原位增殖的影响,结果表明四组组合均不同程度提高了小鼠肝脏中原位Ki67阳性细胞比例,其中LS和LT组合阳性比例分别高达18.83%±0.92%和11.82%±1.82%。接下来是以溶血磷脂酸为基础分子筛选促进肝脏细胞原位增殖活性分子及其组合。通过筛选发现溶血磷脂酸单独给药组小鼠肝脏中Ki67阳性细胞比例仅为4.39%±0.95%,TGFβ受体抑制剂和GSK3抑制剂的分别加入反而降低了Ki67阳性细胞比例。接下来是以p38 MAPKs抑制剂为基础分子筛选促进肝细胞原位增殖的活性分子及其组合。结果显示p38 MAPKs抑制剂单独处理对小鼠肝脏原位Ki67阳性细胞比例没有显著影响,其分别与TGFβ受体抑制剂和GSK3抑制剂组合可以提高小鼠肝脏原位Ki67阳性细胞比例,但其Ki67阳性细胞比例仅仅达到2%左右。接下来是以前列腺素E2的衍生物为基础分子筛选促进肝脏细胞原位增殖的活性分子及组合。筛选结果表明前列腺素E2的衍生物处理的低剂量组可以启动小鼠肝脏原位细胞增殖程序,并且避免了高剂量组导致的肝损伤和小鼠死亡情况,其与TGFβ受体抑制剂组合并不能有效提高小鼠肝脏原位增殖细胞的比例,而与GSK3抑制剂可以显著提升小鼠肝脏中原位细胞的增殖能力,且高于单独处理的低剂量组。最后是以TLR激动剂为基础分子筛选促进肝细胞原位增殖的活性分子。基于前期筛选结果,我们推测TLR激动剂对于肝脏原位细胞增殖的启动具有重要的作用,结合相关文献的报道,我们选择TLR激动剂CR来探究小分子化合物CR对于小鼠肝脏中原位细胞增殖启动的影响。结果表明TLR激动剂CR处理组小鼠肝脏增殖细胞比例为12.66%±2.94%,显著高于对照组。综合上述筛选过程,最终我们选择TGFβ受体抑制剂和TLR激动剂S的组合(LS)、TGFβ受体抑制剂和核受体激动剂的组合(LT)、PGE2的衍生物和GSK3抑制剂的组合(dm C2)以及TLR激动剂CR作为下一步研究的小分子化合物及组合做进一步的探究。第二部分是探究活性小分子化合物及组合在非酒精性脂肪肝疾病模型中的疗效。研究表明脂肪肝会抑制正常的再生程序,因此我们尝试探究活性小分子化合物及组合在非酒精性脂肪肝疾病模型中的疗效。实验结果表明小分子化合物组合LS和LT改善了非酒精性脂肪肝小鼠模型的脂肪变性程度,但却导致了非酒精性脂肪肝模型小鼠的死亡。在非酒精性selleckchem AZD1152-HQPA脂肪肝模型小鼠中,小分子化合物组合dm C2和小分子化合物CR的处理均显著改善了模型小鼠肝脏的组织结构,降低了脂肪变性和活化的肝星状细胞的比例,促进了非酒精性脂肪肝小鼠模型肝脏中原位细胞的增殖,显著提升了模型小鼠的肝重比,同时显著改善了小鼠的肝功能指标和血脂指标。因此我们选择dm C2和CR作为重点研究的小分子化合物组合,小分子化合物组合LS和LT有待进一步地研究和优化。第三部分是小分子化合物及组合处理下肝脏的结构、功能及其毒副作用的评价。众所周知,肝损伤可以启动肝再生,因此我们评价了小分子化合物及组合对于肝脏的毒副作用,排除小分子化合物的毒副作用导致肝损伤进而启动肝再生的情况,结果显示小鼠肝脏肝小叶结构完整清晰,未见明显的损伤灶,血清肝功能指标均未超出正常值范围,即未造成明显的肝损伤及肝脏毒副作用。接下来是对小分子化合物及组合处理下肝脏功能性分子表达的评价,小分子化合物及组合处理的肝脏功能性分子肝细胞核因子4α(Hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α)和白蛋白(Albumin,Alb)没有异常变化,其与Ki67免疫荧光共染表明增殖细胞绝大部分为肝细胞,同时肝脏代谢酶细胞色素P450家族2亚家族E成员1(Cytochrome P450 Family 2 Subfamily E Member 1,CYP2E1)也未见异常变化,其与Ki67免疫荧光共染提示增殖的肝细胞可能主要分布于肝小叶Ⅱ区。接下来是对小分子化合物及组合处理条件下肝脏结构的评价,肝脏组织纤维状肌动蛋白染色表明肝细胞骨架结构完整清晰,胆小管标志物二肽基肽酶(Dipeptidyl peptidase 4,DPP4)染色显示肝脏中增殖细胞和非增殖细胞均可以检测到胆小管标志物DPP4的表达,同时Ki67分别与肝祖细胞标志物SOX9和AFP共染结果显示小分子化合物及组合处理启动了肝脏的再生程序,但未检测到肝细胞去分化为肝祖细胞的过程。最后是明确小分子化合物及组合处理条件下增殖肝细胞的肝小叶定位。Ki67和β-Catenin免疫荧光共染色提示Ki67阳性增殖肝细胞主要分布于中央静脉和门静脉之间的Ⅱ区,进一步门静脉区标志物上皮钙黏蛋白(E-cadherin,E-CAD)、中央静脉区标志物谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)和细胞增殖指标Ki67免疫荧光共染色表明小分子化合物及组合处理的实验组小鼠肝脏中增殖肝细胞以中央静脉为中心,主要定位于肝小叶中央静脉和门静脉之间的Ⅱ区。第四部分是活性分子及组合促进肝细胞增殖分子机制的初步探究。众所周知,Hippo信号通路在损伤后的肝再生中具有重要的作用,然而小分子化合物及组合处理的肝细胞特异性敲除Yap的小鼠结果表明肝细胞特异性敲除Yap并未显著降低小分子化合物及组合启动的肝脏中增殖肝细胞的比例,Yap不是小分子化合物及组合启动肝再生所必需的。接下来我们分析了小分子化合物及组合启动肝再生后转录组表达谱的变化,转录组数据表明小分子化合物组合dm C2处理实验组的差异基因中下调基因占比78.3%,富集分析数据表明小分子化合物组合dm C2处理的对照组细胞增殖负向调控通路显著富集,提示小分子化合物组合dm C2可能主要通过下调细胞增殖相关负向调控信号通路启动肝再生,与小分子化合物组合dm C2处理实验组不同,小分子化合物CR处理实验组差异基因主要为上调基因,占比90.59%,进一步富集分析数据表明小分子化合物CR处理的实验组细胞增殖相关信号通路显著Pulmonary Cell Biology富集,提示小分子化合物CR可能主要通过上调细胞增殖相关信号通路启动肝再生。对于明确的单一靶点的小分子化合物CR,我们进一步探究了小分子化合物CR同靶点化合物S是否可以同样启动肝再生,结果表明CR同靶点小分子化合物S单独处理野生型小鼠也可以显著提升小鼠肝脏中原位增殖细胞比例,提示该靶点在小鼠肝脏肝细胞原位增殖中具有重要的作用。同时对于明确的单一靶点的小分子化合物CR,我们探究了其下游分子肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)在小分子化合物CR启动肝再生中的作用,结果表明TNF-α抑制剂阿达木单抗的处理并没有显著降低小分子化合物CR处理的实验组的肝重比和肝脏中原位增殖的肝细胞数量。本研究利用野生型小鼠进行促进肝脏细胞原位增殖的活性分子的化学筛选,经过筛选获得了四组可以显著启动肝原位再生的小分子化合物及组合,对其给药时间进行优化后,我们探究活性小分子化合物及组合在非酒精性脂肪肝疾病模型中的作用。我们发现小分子化合物及组合均可以显著改善模型小鼠肝脏的组织结构和脂肪变性,但是小分子化合物组合LS和LT会导致一定比例的模型小鼠死亡,其给药时间和剂量等因素有待进一步优化,而小分子化合物组合dm C2和小分子化合物CR则不会导致模型小鼠死亡,进一步地研究表明小分子化合物组合dm C2和小分子化合物CR降低了活化的肝星状细胞的比例,促进了非酒精性脂肪肝小鼠模型肝脏中原位细胞的增殖,显著提升了模型小鼠的肝重比,同时显著改善了小鼠的肝功能指标和血脂指标。接下来我们评价了小分子化合物及组合处理下肝脏的结构、功能及其毒副作用,并进一步明确了小分子化合物及组合启动的肝脏中增殖肝细胞的肝小叶定位。最后我们对活性分子及组合促进肝细胞增殖的分子机制做了初步的探究,后续将继续深入挖掘其机制。通过本课题的研究,我们建立了有效的促进肝脏再生的化学干预手段,为肝脏再生机制的探究以及肝再生损伤等相关疾病的治疗提供新思路。

目的 探讨藤黄酸对肾透明细胞癌凋亡及铁死亡的影响。方法 使用不同浓度藤黄酸干预786-O及ACHN细胞24 h, CCK-8法检测细胞活力以筛选合适的作用浓度。流式细胞术检测细胞活性氧(ROS)和线粒体活性氧(mitoROS)水平，铁离子比色法检测试剂盒检测游离铁水平变化，Western blot法检测凋亡蛋白(Bcl-2、Bax)和铁死亡蛋白(FTH1、GPX4)表达。结果 藤黄酸能够抑制786-O、ACHN细胞活力，并浓度依赖性地升高细胞凋亡率和ROS、mitoROS、游离铁水平(P<0.05,P<0.01)。添加铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)后可在一定程度上恢复藤黄酸诱导的ROS、mitoROS、游离铁水平变化(P<0.05,P<0.01)。藤黄酸干预后，786-O、ACHN细胞的铁死亡标志性蛋白FTH1和GPXIntegrated Chinese and western medicine4表达均降低(P<0.05,P<0.01),且Fer-1部分恢复了FTH1和GPX4蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论 藤黄酸可能通过下调Bcl-2/Bax比值诱导肾透明细胞癌凋亡LEE011 NMR，并通过抑制FTH1和GPselleckchem R428X4蛋白表达诱导铁死亡。