目的:口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)发病率高、恶性程度高且预后较差,已逐渐成为影响人类健康的世界重大公共卫生问题。以顺铂(Cisplatin,CDDP)为主的化疗目前是晚期OSCC最常用的姑息治疗。然而,许多患者对顺铂治疗产生抗药性,甚至因药物相关毒性而死亡。作为一种调节性细胞死亡形式,铁死亡在肿瘤抑制中起着重要作用,铁死亡的激活还有助于多种癌症的治疗。目前在OSCC中同时调控铁死亡和顺铂耐药的分子研究较少,许多潜在分子的作用机制也未知。极光激酶A(Aurora kinase A,AURKA)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,可调节细胞中有丝分裂纺锤体的功能。目前研究已发现AURKA促进多种肿瘤的进展,并在铁死亡以及化疗耐药中发挥着潜在的调节作用。方法:第一部分:1.下载癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)以及高通量基因表达(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中OSCC的RNA测序数据,从中筛选出OSCC和正常口腔组织之间差异表达的铁死亡相关基因(Differentially expressed ferroptosis-related genes,DE-FRGs)。同时,从来自GEO数据库的GSE117872队列中筛选出OSCC顺铂耐药细胞和敏感细胞之间的DE-FRGs。分别使用加权共表达网络分析从三个队列中鉴别出与OSCC以及OSCC顺铂耐药高度相关的铁死亡相关基因模块。获取以上步骤共有的基因定义为与OSCC和OSCC顺铂耐药同时高度相关的DE-FRGs。2.Kaplan-Meier生存分析从中进一步筛选出4个预后相关的差异表达铁死亡相关基因(Prognosis related differentially expressed ferroptosis-related genes,PR-DE-FRGs)。在内部队列(TCGA)中采用时间依赖性受试者工作特征(Receiver operating characteristic,ROC)曲线、Kaplan-Meier生存曲线和一致性指数(Concordance index,C-index)评价并比较4种PR-DE-FRGs预测OSCC患者预后的价值。单变量Cox回归用于进一步确定4个PR-DE-FRGs对TCGA队列中OSCC患者预后的影响。综合比较得到在OSCC患者预后中的预测价值最高的基因—AURKA。外部队列(GSE41613GSE65858)用于进一步验证AURKA在OSCC中的最佳预后价值。3.在TCGA队列中,使用随机森林算法对4个PR-DE-FRGs的重要性评分进行排序,并使用诊断ROC曲线分别评价它们在OSCC的诊断价值。外部队列(GSE30784GSE37991)则用于进一步验证它们的诊断价值。从中筛选出诊断价值最高的基因—AURKA。4.进一步分析TCGA数据库中18种癌症与癌旁组织间AURKA的表达差异,并使用多变量Cox回归确定AURKA是否能独立影响OSCC患者的预后。5.基因集富集分析用于探索AURKA潜在的生物学功能。6.使用TCGA的OSCC测序数据比较不同临床分级、分期以及生存状态亚组之间AURKA表达的差异,并分析AURKA与细胞粘附相关基因表达之间的相关性。7.进一步分析AURKA与铁死亡标志基因表达的相关性。8.进一步分析AURKA与多药耐药基因表达的相关性。第二部分:1.采集OSCC和临近癌旁正常组织标本,搜集临床信息。分别使用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantificational real time polymerase chain reaction,QRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)检测组织中AURKA的RNA和蛋白表达。比较OSCC和正常口腔组织之间AURKA的表达差异,并比较不同临床病理特征亚组患者AURKA的相对RNA水平的差异。2.慢病毒感染SCC9和HSC-3,根据荧光蛋白表达强度选择感染效率最高的感染细胞结合嘌呤霉素筛选得到AURKA过表达的稳转株。QRT-PCR和WB验证稳转株中AURKA的过表达。3.CCK-8检测空白,空载病毒和AURKA过表达SCC9/HSC-3在24,48和72h时细胞的存活率,并比较三组细胞之间存活率的差异。4.划痕实验评估并比较三组细胞迁移能力的差异。5.Transwell评估并比较三组细胞侵袭能力的差异。第三部分:1.检测并比较空白,空载病毒和AURKA过表达SCC9/HSC-3细胞中活性氧以及Fe~(2+)水平的差异。2.QRT-PCR检测并比较三组细胞中铁死亡标志以及NRF2-KEAP1通路基因(GPX4,SLC7A11,FTH1,NRF2和KEAP1)的RNA水平的差异。第四部分:1.CCK-8检测在不同浓度BMS-354825 NMR顺铂处理下的CAL27以及CAL27/CDDP的细胞存活率。分别绘制两组细胞的生长曲线和计算对应的IC50,并分别比较两组细胞间它们的差异。2.QRT-PCR和WB分别检测这两组细胞中AURKA的RNA和蛋白水平,并比较两组间它们的差异。3.慢病毒感染CAL27/CDDP,根据荧光蛋白表达强度选择感染效率最高的感染细胞Nirmatrelvir结合嘌呤霉素筛选得到AURKA过表达的稳转株。QRT-PCR和WB验证稳转株中AURKA的过表达。4.CCK-8检测在不同浓度顺铂处理下的AURKA过表达HSC-3以及CAL27/CDDP的细胞存活率。分别绘制三组细胞的生长曲线和计算对应的IC50,并分别比较三组细胞间IC50的差异。结果:第一部分:1.筛选得到6个与OSCC和OSCC顺铂耐药同时高度相关的DE-FRGs。Kaplan-Meier生存分析初步鉴别出AURKA、SLC2A1、RRM2和DUOX1对OSCC预后有影响。AURKA在这4个PR-DE-FRGs中具有最高的C-index和最高AUC值。单变量Cox回归分析中,只有AURKA显示出对预后的显著影响。外部队列中也得到类似的结果。2.在基于内外部队列的诊断ROC曲线中,AURKA展示出最高的AUC值。3.AURKA在OSCC组织和OSCC顺铂耐药细胞中上调,并在16种癌症中普遍上调。校正相关临床因素后,AURKA仍为OSCC预后的影响因素。4.富集分析观察到AURKA高表达与肿瘤恶性进展功能和通路相关,低表达与铁死亡功能相关。5.更高的临床分级中,AURKA表达更高。ICAM1/EGFR/CD44与AURKA表达量呈显著正相关。6.GPX4/SLC7A11/FTH1与AURKA表达量呈显著正相关。7.AURKA与MRP1(ABCC1)/PGP表达呈显著正相关。第二部分:1.AURKA在OSCC组The fatty acid biosynthesis pathway织中上调。更高的临床分级OSCC患者组织中AURKA的RNA水平显著更高。2.使用MOI=20/80的病毒感染SCC9/HSC-3效率最高。AURKA在对应的SCC9/HSC-3稳转株中显著过表达。3.24,48和72h时AURKA过表达的SCC9/HSC-3的存活率均显著更高。4.AURKA过表达的SCC9/HSC-3在划痕后迁移速率显著更快。5.穿过小室的AURKA过表达的SCC9/HSC-3数量显著更多。第三部分:1.AURKA过表达的SCC9/HSC-3中反应活性氧和Fe~(2+)水平的荧光强度更低。2.AURKA过表达的SCC9/HSC-3中GPX4,SLC7A11,FTH1和NRF2的RNA表达均更高,KEAP1的RNA表达更低。第四部分:1.不同浓度顺铂处理下,CAL27/CDDP存活率显著高于CAL27,CAL27/CDDP的IC50显著高于CAL27。3.CAL27/CDDP中AURKA的RNA和蛋白表达水平均高于CAL27。4.使用MOI=40的病毒感染CAL27/CDDP效率最高。AURKA在稳转的CAL27/CDDP中显著过表达。5.不同浓度顺铂处理下AURKA过表达HSC-3以及CAL27/CDDP存活率显著更高,对应的IC50也显著更高。结论:第一部分:1.生信鉴定并验证出AURKA具有最佳诊断和预后价值,该基因与OSCC和OSCC顺铂耐药高度相关。2.AURKA在包括OSCC在内的17种癌症以及OSCC顺铂耐药细胞中上调,并能独立负向影响预后。3.AURKA表达增加可能促进OSCC的恶性进展,抑制铁死亡,并促进顺铂耐药。第二部分:1.AURKA在OSCC组织中表达上调,AURKA表达增加可能促进OSCC的恶性进展。2.AURKA表达增加促进SCC9/HSC-3的增殖。2.AURKA表达增加促进SCC9/HSC-3的迁移。3.AURKA表达增加促进SCC9/HSC-3的侵袭。第三部分:AURKA表达增加抑制OSCC中的铁死亡,这一作用可能通过NRF2-KEAP1通路来实现。第四部分:AURKA在CAL27/CDDP中上调,AURKA表达增加降低OSCC细胞对顺铂的敏感性并促进顺铂的耐药。