目的:甲基汞(Methylmercury,Me Hg)是一种普遍存在于水体中的环境污染物,能够透过血脑屏障,对中枢神经系统造成严重损害。人类主要靠食用受污染的鱼贝类和水稻接触Me Hg,从而引发严重的健康问题。研究表明Me Hg诱导线粒体损伤和细胞凋亡是其发挥神经毒性作用的重要过程。Me Hg的蓄积会破坏线粒体的结构和功能,从而引发线粒体应激和凋亡,最终引起细胞死亡。线粒体未折叠蛋白反应(Mitochondrial Unfolded Protein Response,UPR~(mt))是一种线粒体应激反应,它在应激状态时被激活,以维持线粒体内蛋白的稳定。为了活化UPR~(mt),哺乳动物体内需要转录激活因子4(Activating Transcription Factor 4,ATF4)和C/EBP同源蛋白(C/EBP-Homologous Protein,CHOP)的参与,但Me Hg诱导UPR~(mt)的分子机制尚未明确。本研究旨在阐明Me Hg对线粒体凋亡途径的诱导作用,以及在该过程中ATF4/CHOP轴对UPR~(mt)的调节作用,为Me Hg神经毒性的防制提供实验和理论依据。方法:1、利用昆明小鼠建立Me Hg暴露体内模型。将56只SPF级成年昆明小鼠随机分为对照组、4μmol/kg Me Hg组、8μmol/kg Me Hg组和12μmol/kg Me Hg组共4组,每组14只,雌雄各半。经过28天的灌胃染毒,每日监测体重变化,通过爪抓力和步态实验检测小鼠神经行为学损伤。随后处死小鼠,取大脑皮质进行后续实验。冷原子吸收法检测小鼠大脑皮质汞含量,尼氏染色检测小鼠大脑皮质神经细胞病理学变化,流式细胞术检测线粒体膜电位,q PCR检测线粒体DNA拷贝数,Western Blot检测大脑皮质中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、Cyt C的蛋白表达,RT-q PCR和Western Blot检测ATF4、CHOP以及UPR~(mt)相关蛋白HSP70、HSP60、CLPP、Lon P1的m RNA和蛋白表达水平,免疫组化检测ATF4和CHOP的阳性细胞比例,免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)检测ATF4和CHOP的相互作用,探究Me Hg暴露对大脑皮质线粒体损伤和细胞凋亡的诱导作用。2、通过HT22细胞系建立Me Hg暴露体外模型,并应用ATF4、CHOP小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)进行预处理。实验分为对照组、4μM Me Hg组、control si RNA组、ATF4 si RNA+Me Hg组和CHOP si RNA+Me Hg组。通过荧光显微镜观察si RNA转染的效率,达70%以上,为后续实验提供了可靠的依据。通过免疫荧光检测CHOP荧光强度,观察ATF4对CHOP的激活作用。采用流式细胞术和Western Blot技术,检测细胞凋亡率和凋亡蛋白cleaved caspase-3和Cyt C的表达水平,以及ATF4/CHOP轴对凋亡的影响。通过Western Blot检测ATF4、CHOP、HSP70、HSP60、CLPP、Lon P1的蛋白表达变化,探究在Me Hg致神经元细胞凋亡过程中ATF4/CHOP轴对UPR~(mt)的调节作用,进一步研究Me Hg的神经毒性机制。结果:1、与对antitumor immune response照组相比,Me Hg染毒组小鼠的爪抓力呈剂量依赖性减弱。在步态分析实验中,Me Hg染毒组小鼠的身体速度和协调性明显降低。各组小鼠大脑皮质汞含量均明显升高。尼氏染色显示Me Hg染毒组小鼠大脑皮质神经细胞形态受损,尼氏小体数量减少并伴有体积减小。凋亡相关蛋白Bax、cleaved caspase-3、Cyt C的蛋白表达量随Me Hg染毒剂量增加不断升高,Bcl-2呈下降趋势。与对照组相比,各Me Hg染毒组线粒体DNA拷贝数和线粒体膜电位逐渐下降。随着染毒剂量的增加,ATF4、CHOP以及UPR~(mt)相关蛋白HSP70、HSP60、CLPP、Lon P1的蛋白和m RNA表达上调Tamoxifen核磁,ATF4和CHOP阳性细胞染色面积逐渐升高,ATF4和CHOP的蛋白相互作用明显增加。2、与对照组相比,Me Hg染毒组中CHOP的荧光强度显著增强,ATF4/CHOP si RNA预处理组的荧光强度明显减弱。经Me Hg染毒处理后,cleaved caspase-3和Cyt C的表达水平显著提升,而ATF4/CHOP si RNA预处理则导致这两种蛋白的表达水平显著降低。UPR~(mt)相关蛋白HSP70、HSP60、CLPP、Lon P1表达水平的升高在ATF4/CHOP si RNA预selleck合成处理后显著降低。结论:1、Me Hg暴露诱导神经细胞UPR~(mt)及凋亡,导致小鼠神经系统功能损伤。2、Me Hg暴露可通过活化ATF4/CHOP轴调节UPR~(mt),诱导神经细胞凋亡。