双酚A(Bisphenol A,BPA)作为重要的化工原料,在生活中广泛存在,包括婴幼儿用品(如奶瓶、吸口杯)、食品包装容器(如奶粉罐内衬涂层)及热敏纸(超市小票)等。值得注意的是BPA具有典型的环境雌激素效应,可以和核内外多种受体结合影响多种发育相关的通路。大量研究表明,BPA暴露可通过氧化应激和DNA损伤等途径诱导猪、牛等家养动物胚胎发育停滞、异常及妊娠终止,发挥胚胎发育毒性,然而目前针对其毒性的防控研究较少。维生素C(Vitamin C,VC)能够通过清除自由基和抑制脂质过氧化反应发挥抗氧化作用,并通过修复DNA损伤Torin 1、抵抗基因突变等途径发挥抗DNA损伤作用,并在多种领域得到广泛应用。本研NN2211抑制剂究以VC的抗氧化和抗DNA损伤功能为切入点研究VC对BPA引起的胚胎发育畸形的缓解作用,从以下三方面进行研究。1.维生素C对BPA胚胎发育毒性的缓解作用本研究使用发育毒理学模式动物非洲爪蟾(Xenopus laevis,X.laevis)研究BPA的胚胎发育毒性及VC对其的干预作用。研究设对照组、BPA暴露组(1μM、10μM)、VC对照组(50μΜ)、VC干预组(1μM BPA+50μM VC、10μM BPA+50μM VC),进行96 h急性暴露试验。死亡率和畸形率统计表明BPA导致胚胎死亡率和畸形率的显著升高(P<0.05),VC可抑制BPA的致死致畸毒性。发育指标结果表明1μM BPA和10μM处理组的胚胎眼直径、全长和头长均显著小于对照组(P<0.01);与BPA组相比,BPA+VC组的全长、头长和眼直径均显著恢复(P<0.01)。SOM(Score of malformation,SOM)结果表明BPA暴露胚胎的畸形率及畸形评分显著增加(P<0.001)。VC干预显著降低BPA暴露胚胎的畸形率和畸形评分(P<0.05)。BPA显著降低胚胎的触碰反应(P<0.01),此外,小动物行为监测显示BPA显著干扰自主游动轨迹、显著降低游动速度和距离(P<0.001),添加VC能够缓解BPA导致的胚胎运动行为能力受损。以上结果表明BPA具有明显的胚胎发育毒性,VC可干预BPA的胚胎发育毒性,缓解BPA导致的胚胎生长发育障碍、胚胎畸形及行为能力受损。2.维生素C缓解BPA致胚胎体轴弯曲的机制研究体轴畸形是BPA致胚胎发育畸形的主要表型,为阐明impulsivity psychopathologyVC缓解BPA致胚胎体轴畸形的机制,本研究从组织病理学、氧化应激、DNA损伤和细胞凋亡方面进行研究。HE(hematoxylin-eosin,HE)染色结果显示,1μM和10μM BPA暴露的胚胎脊索液泡细胞发生萎缩,两侧肌肉组织受损,体节不清;添加VC能够缓解BPA导致的脊索及两侧肌肉组织结构损伤,恢复液泡细胞形态以及体节分节。q RT-PCR(quantitative real time PCR,q RT-PCR)结果表明BPA暴露可导致胚胎抗氧化相关基因(gpx4、sod、cat.2、ppard)转录水平显著下降(P<0.05);VC显著抑制BPA导致抗氧化相关基因m RNA水平下降(P<0.05)。单细胞凝胶电泳(single-cell gel electrophoresis,SCGE)结果显示,BPA暴露导致胚胎DNA损伤相关指标显著升高(P<0.001),而VC显著抑制了BPA导致的胚胎DNA损伤指标的升高(P<0.01);同时,TUNEL(Terminal deoxynu-cleotidyl transferase mediated d UTP nick-end labeling,TUNEL)结果显示BPA暴露胚胎脊索发生凋亡,VC抑制凋亡发生。q RT-PCR结果表明BPA导致胚胎凋亡及p53通路相关基因(Bax/Bcl-2比值、caspase-3、p53、atm、chk2)转录水平显著上升(P<0.05);VC显著抑制BPA诱导的Bax/Bcl-2、caspase-3、p53、atm、chk2基因转录水平的升高(P<0.05)。以上结果表明BPA降低胚胎的抗氧化能力并诱导DNA损伤,通过p53通路诱导胚胎脊索细胞凋亡,最终导致胚胎脊索组织受损;VC能够改善抗氧化基因的表达,缓解DNA损伤,抑制p53通路的激活,最终干预BPA导致的胚胎细胞凋亡恢复脊索组织形态。3.维生素C缓解BPA致胚胎细胞凋亡的机制研究本研究选用具有胚胎干细胞分化特性的P19细胞(P19 Stem Cells,P19SCs)作为体外模型,设Con组、BPA处理组(50μM、100μM)、VC对照组(15μΜ)、VC干预组(50μM BPA+VC 15μΜ、100μM BPA+VC 15μΜ)六组。实时无标记细胞分析技术(Real-time cellular analysis,RTCA)监测显示BPA显著降低P19SCs的平均细胞指数(P<0.05),VC显著抑制BPA导致的细胞指数下降(P<0.001),ROS检测结果显示50μM BPA和100μΜ处理组的活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量均显著上升(P<0.001);与BPA组相比,BPA+VC共处理组的ROS含量显著下降(P<0.01)。SCGE检测P19SCs DNA的完整性并通过Western blot检测DNA损伤标志物γ-H2AX(phosphorylated histone H2AX,γ-H2AX)的表达,结果表明50μM BPA和100μΜ处理组的DNA损伤指标显著升高(P<0.001),VC显著抑制BPA引起的DNA损伤(P<0.01)。Western blot结果显示BPA显著上调γ-H2AX和cleaved Caspase-3的表达量(P<0.001),共处理组中二者的表达量与BPA处理组相比显著下调(P<0.05)。流式细胞术结果表明50μM BPA和100μM处理的P19SCs中凋亡细胞的比例增加,共处理组凋亡细胞比例下降。q RT-PCR和Western blot结果显示BPA上调了atm、chk2和p53的基因转录以及ATM、CHK2、p-CHK2和p53蛋白表达(P<0.05),说明BPA激活ATM/CHK2/p53信号通路;添加VC显著抑制ATM/CHK2/p53信号通路的激活(P<0.05)。q RT-PCR结果显示BPA显著上调ATM/CHK2/p53信号通路下游线粒体凋亡相关基因Bax和Puma的m RNA水平及Bax/Bcl-2比值(P<0.01);BPA和VC共处理显著下调Bax、Puma的m RNA水平及Bax/Bcl-2比值(P<0.05)。以上结果说明BPA诱导P19SCs的氧化应激和DNA损伤,通过激活ATM/CHK2/p53信号通路促进下游线粒体相关凋亡基因Bax和Puma的转录,进而引起P19SCs的凋亡,造成细胞活力下降;添加VC可干预BPA引起的氧化应激和DNA损伤,抑制ATM/CHK2/p53信号通路的激活,缓解P19SCs的凋亡。综上所述,VC干预BPA引起的胚胎细胞氧化应激及DNA损伤,抑制BPA诱导的ATM/CHK2/p53信号通路的激活,缓解BPA诱导的胚胎细胞凋亡,减轻胚胎脊索及两侧肌肉组织的损伤,最终缓解BPA导致的胚胎体轴畸形。研究VC对细胞凋亡的干预作用为预防BPA胚胎致畸毒性及相关环境雌激素的发育毒性提供依据。