研究背景:胃癌(Gastric cancer,GC)是全球范围内第五大高发恶性肿瘤,死亡率居肿瘤死亡第四位,是严重的全球健康问题。胃癌的发生发展是一个环境因素与宿主因素相互作用的多因素多阶段的复杂过程。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染是胃癌发生发展过程中最重要的环境因素之一,不仅能够启动Correa级联反应触发肠型胃癌的发生,又能长期定植于肿瘤、上皮、免疫细胞中,甚至向胃黏膜外转移,触发多种接头蛋白的信号级联反应,导致核因子激活,产生细胞因子和炎症因子,促进胃癌的侵袭转移、上皮间质转化、血管生成等恶性生物学行为,不仅使胃癌发病风险升高还能促进胃癌的进展影响预后,但其致病机制仍不清楚。近年来,研究发现H.pylori感染也与糖尿病、高血压、高血脂、代谢综合征(Metabolic Syndrome,Met S)等胃外全身性疾病密切相关,也有研究报道H.pylori感染能够影响糖酵解、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、能量代谢等代谢途径,提示我们H.pylori感染可能影响人体的代谢稳态。代谢重塑是恶性肿瘤的标志之一,从代谢组学水平上表现为糖酵解增强,有氧呼吸受损、氨基酸上调、脂质生成增加、脂肪酸β氧化增强等,在胃癌的发生发展中也起到重要作用,不仅为癌细胞增殖提供能量,还能促进肿瘤加速进展,而癌细胞代谢变化又与微环境相互调节,而H.pylori作为在人体内定居的重要微生物群落之一,其与胃癌代谢的调控机制尚不清楚。H.pylori感染是否能够影响胃癌的代谢表型,其导致胃癌代谢表型变化的机制如何有待探索。研究目的:探讨H.pylori感染对胃癌代谢表型的影响及其介导胃癌细胞异常代谢的作用机制。研究方法:第一部分:幽门螺杆菌感染对胃癌代谢表型的影响-基于临床资料的研究1、研究对象:本研究是一项横断面研究,回顾性收集了胃癌患者的临床资料,共纳入胃癌病例337例,平均年龄62.76岁,男性223例,女性114例,H.pylori阳性率64.7%。纳入标准为:1)2013年3月-2021年8月于中国医科大学附属第一医院接受胃癌手术的患者;2)经组织病理学检查确诊为胃癌。排除标准为:1)术前接受过化疗或者放疗、二次复发手术者;2)合并其他恶性肿瘤或有恶性肿瘤病史者;3)合并其他重大慢性疾病,如脑卒中、严重心、肝、肾功能不全;4)既往进行过根除H.pylori治疗。从病志中提取实验室检查和临床资料。本研究获中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准并签署知情同意书。2、H.pylori感染的检测:H.pylori感染的判定采用H.pylori Ig G抗体检测试剂盒(胶体金法),严格按照试剂盒说明书操作。3、Met S的定义及相关成分的测定:本研究采用询问或者病志中获取每个受试者的流行病学数据和医学信息;采用标准化人体测量方法测量身高、体重,以平均值作为最终指标;在仰卧位和坐位测量血压;BMI的计算方法是体重(公斤)/身高(米)2;手术治疗前采集静脉血,测量血糖、血脂(甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇)等指标;根据中国糖尿病协会标准对Met S进行诊断。4、统计分析:本研究采用SPSS v22.0软件进行统计分析。连续变量符合正态分布数据用均数±标准差(mean±SD)表示,采用t检验评价两组间差异;不符合正态分布的连续变量用中位值(25百分位数,75百分位数)表示,采用非参数Mann-Whitney U检验评价两组间差异。分类变量用数字或百分比表示,组间差异比较采用卡方检验。双侧P<0.05,差异有统计学意义。第二部分:幽门螺杆菌感染对胃癌代谢表型的影响-基于代谢组学的研究1、研究对象:本研究共纳入30例新鲜胃癌组织样本,来自2012年6月至2014年6月中中国医科大学附属第一医院接受胃癌手术的患者;接受过术前放化疗或既往进行过H.pylori根除治疗的患者被排除在外;研究经中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准并签署知情同意书。AGS胃癌细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心,具有STR鉴定证书;H.pylori标准菌株购自美国ATCC微生物菌株保藏中心,编号ATCC 26695。2、胃癌组织H.pylori感染鉴定:采用三种方法鉴定H.pylori感染状况,包括H.pylori保守基因PCR扩增、Warthin-Starry染色和H.pylori Ig G抗体检测,两种方法阳性判定为H.pylori感染。3、构建H.pylori与AGS细胞共培养模型:微需氧条件下(85%N2、5%O2、10%CO2),H.pylori复苏后于BHI平板进行培养;AGS细胞使用加入胎牛血清的RPMI-1640完全培养基培养至对数生长期;制备细菌悬液,以H.pylori(MOI=100:1)感染AGS细胞24h,构建共培养模型。4、代谢物提取与非靶向代谢组学测序:1)胃黏膜组织:代谢物按常规标准进行提取后通过Vanvosh超高效液相色谱-质谱系统与Orbitrap Q Exactive TM HF质谱仪结合Hypesil Gold色谱柱上机进行测序。下机数据进行搜库与mz Cloud、mz Vault、Mass List数据库匹配获取代谢物定性和相对定量结果。2)胃癌细胞:代谢物按常规标准进行提取后通VCell Biologyanquish超高效液相系统与Thermo Orbitrap Exploris 120质谱检测器结合进行测序。下机数据与HMDB massbank,Lipid Maps,mzcloud比对鉴定代谢产物。5、差异代谢物筛选鉴定及通路富集分析:利用VIP>1和P<0.05筛选确定差异代谢物,使用HMDB数据库进行代谢物注释。通过KEGG数据库基于Metabo Analyst5.0网站进行代谢功能富集分析。第三部分:幽门螺杆菌介导胃癌细胞异常脂肪酸代谢的作用机制研究1、研究对象:HGC27胃癌细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心,具有STR鉴定证书。AGS细胞系和H.pylori标准菌株来源同第二部分。2、共培养模型构建:构建Si RNA干扰AGS细胞株,以H.pylori(MOI=100:1)感染AGS细胞和Si RNA干扰AGS细胞24h,构建细菌-细胞共培养模型。3、RNA文库构建、转录组测序及数据分析:利用Trizol法提取总RNA并进行质量检测。使用KC-Digital TM Stranded m RNA Library Prep Kit for Illumina(?)进行RNA测序文库制备。最终在PE150模型的Novaseq 6000测序仪(Illumina)上进行测序。原始测序数据下机后进行清洗,使用edge R包确定组间差异表达的基因(P<0.05且|log2FC|>1)。GO和KEGG富集分析均通过KOBAS软件完成,P<0.05具有统计学意义。4、利用Trizol法提取细胞总RNA,利用Mon Script TMRTIII All-in-One Mix with ds DNase反转成c DNA后应用realtime PCR检测ACSL5 m RNA表达量变化。5、提取细胞总蛋白,利用BCA蛋白浓度检测试剂盒进行蛋白浓度定量,利用Western blot法检测ACSL5蛋白表达量的变化。6、提取细胞长链脂肪酰基辅酶A(fatty acyl-Co As),利用超高效液相色谱-串联四极杆质谱进行定量分析。7、按照增强型ATP检测试剂盒操作流程提取细胞ATP,利用化学发光法对实验组和对照组的细胞ATP含量进行检测。8、按照NADP+/NADPH检测试剂盒操作流程提取细胞NADP+、NADPH,利用酶标仪对实验组和对照组细胞NADP+/NADPH比值进行检测。9、统计分析采用SPSS v22.0和GraphPad Prism v7.0软件,正态分布资料两组间差异分析采用t检验,偏态分布资料组间差异分析采用非参数检验。P<0.05被认为具有统计学意义。第四部分:脂肪酸代谢关键酶ACSL5对胃癌细胞生物学功能的影响及临床意义1、研究对象:组织标本来自2012年12月至2019年12月于中国医科大学附属第一医院就诊患者,其中新鲜胃癌及远端正常组织标本30对,石蜡包埋组织标本368例。石蜡包埋组织标本中包含非萎缩性胃炎(NAG)40例、肠化型萎缩性胃炎(IM-GA)84例,胃癌(GC)244例。其中,80例GC具有癌旁IM-GA及远端正常组织;118例GC患者具有完整临床病理资料以及随访信息,随访截止至2022年6月。本研究经中国医科大学附属第一医院医学伦理委员会批准并签署知情同意书。AGS及HGC27胃癌细胞系均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心,两种细胞系均具有STR鉴定证书。2、构建ACSL5慢病毒过表达、Si RNA干扰胃癌细胞系。3、利用Trizol法提取细胞总RNA,利用MonScript TMRTIII All-in-One Mix with ds DNase反转录后应用实时荧光定量PCR检测ACSL5 m RNA表达量变化。4、提取细胞总蛋白,利用BCA蛋白浓度检测试剂盒进行蛋白浓度定量,利用Western blot检测ACSL5蛋白表达量的变化。5、利用CCK-8实验、EdU荧光染色实验检测细胞的增殖能力;利用划痕愈合实验、Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验检测细胞的迁移、侵袭能力。6、免疫组化染色检测胃黏膜组织ACSL5原位表达。7、统计分析采用SPSS v22.0和Graph Pad Prism v7.0软件,正态分布资料两组间差异分析采用t检验,偏态分布资料组间差异分析采用秩和检验。采用卡方检验评估蛋白表达与临床病理参数相关性。采用受试者操作曲线(ROC)对诊断价值进行评价。通过log-rank检验进行生存分析。P<0.05被认为具有统计学意义。研究结果:第一部分:幽门螺杆菌感染对胃癌代谢表型的影响-基于临床资料的研究1、H.pylori感染与胃癌患者代谢特征分析H.pylori阳性组空腹血糖(P=0.009)、收缩压(P<0.001)、舒张压(P=0.01)水平显著高于H.pylori阴性组。H.pylori阳性组HDL-C水平显著低于H.pylori阴性组(P=0.007)。2、H.pylori感染与胃癌患者代谢特征分层分析按性别分层:在男性组中,H.pylori阳性组收缩压(P<0.001)、舒张压(P=0.005)、血糖(P=0.024)显著升高,HDL-C显著降低(P=0.026)。H.pylori主要与血压、血糖、脂代谢紊乱相关。在女性组中,H.pylori阳性组血糖(P=0.023)显著升高,HDL-C显著降低(P=0.025)。H.pylori感染主要与血糖、脂代谢紊乱相关。按年龄分层:在大于60岁的人群中,H.pylori阳性组血糖(P=0.003),收缩压(P=0.005)、舒张压(P=0.043)显著升高。H.pylori主要与血糖、血压异常相关。在小于等于60岁的人群中,有吸烟史的人群H.pylori感染率更高,H.pylori阳性组收缩压(P=0.007)、舒张压(P=0.044)升高,HDL-C显著降低,血脂的差异主要集中在女性人群中(P=0.005)。按疾病进展分层:在早期胃癌的人群中,H.pylori阳性组血糖(P=0.019)、舒张压升高(P=0.037),TG有升高趋势(P=0.078),HDL-C显著降低(P=0.027)。H.pylori主要与血糖、血压、血脂紊乱相关。在进展期胃癌人群中,H.pylori阳性组收缩压(P<0.001)、舒张压(P=0.016)显著升高。3、H.pylori感染与胃癌患者代谢综合征发生率的差异分析分析共纳入所有代谢相关指标完整病例258例。H.pylori阳性组BMI升高(P=0.022)、血脂紊乱(P=0.011)、血糖升高(P=0.036),高血压的发生率呈现升高趋势(P=0.085),代谢综合征的发生率显著高于H.pylori阴性组(P=0.007)。第二部分:幽门螺杆菌感染对胃癌代谢表型的影响-基于代谢组学的研究1、H.pylori感染对胃癌组织代谢表型的影响(1)H.pylori感染状态的判定经H.pylori保守基因检测、Warthin-Starry染色及血清Ig G三种方法综合判定,30例新鲜胃癌标本中有16例为H.pylori感染阳性,14例为H.pylori阴性,阳性率53.33%。(2)H.pylori感染与非感染胃癌组织差异代谢物分析11个代谢物在H.pylori阳性及阴性胃癌组织中存在富集差异。其中胆汁酸、顺-2-二十二碳烯酸、珊瑚脂酸F、γ-依兰油烯、GSK126石榴酸、肾上腺甾酮、p-薄荷-1,3,8-三烯在H.pylori阳性胃癌组织中呈现高度富集,8Z,11Z,14Z-二十碳三烯酸、花生四烯酸、白杨素、L-组氨酸在H.pylori阳性胃癌组织中呈现低度富集。(3)H.pylori感染与非感染胃癌组织差异代谢物通路富集分析H.pylori感染主要与不饱和脂肪酸生物合成、β-丙氨酸代谢、组氨酸代谢、花生四烯酸代谢等通路相关。不饱和脂肪酸合成通路是H.pylori影响胃癌组织最为显著的代谢通路,涉及到的代谢物主要包括8Z,11Z,14Z-二十碳三烯酸和花生四烯酸。2、H.pylori感染对AGS胃癌细胞代谢表型的影响(1)H.pylori感染与非感染AGS胃癌细胞差异代谢物分析H.pylori感染AGS细胞与对照组AGS细胞之间共筛选出99种差异代谢物,其中52种代谢物在H.pylori感染AGS细胞中高度富集,47种在H.pylori感染AGS细胞中低度富集。(2)H.pylori感染与非感染AGS细胞差异代谢物通路富集分析H.pylori感染主要与ABC转运蛋白,肿瘤的中心碳代谢、嘌呤代谢、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、泛酸和辅酶A生物合成等通路相关。差异代谢物能够富集到不饱和脂肪酸合成代谢通路,涉及到的代谢物主要包括棕榈酸、亚油酸、γ亚麻酸、芥酸、二十二碳五烯酸(22n-3)。第三部分:幽门螺杆菌介导胃癌细胞异常脂肪酸代谢的作用机制研究1、H.pylori介导胃癌细胞异常脂肪酸代谢关键调控分子的筛选及鉴定(1)H.pylori感染对AGS细胞转录组学影响的研究H.pylori感染AGS细胞与对照组之间共筛选出1473个差异基因,其中961个m RNA表达上调,512个m RNA表达下调。GO和KEGG富集分析发现差异基因参与多种代谢相关通路。(2)H.pylori感染影响AGS细胞脂肪酸代谢通路及相关基因分析在GO数据库中,富集出3条脂肪酸相关代谢通路、涉及18个基因,分别为脂肪酸代谢过程、长链脂肪酸代谢过程以及不饱和脂肪酸代谢过程;在KEGG数据库中,富集出脂肪酸合成代谢通路,涉及3个基因。两个数据库共同涉及的脂肪酸代谢基因有3个,按照P值排序分别是ACSL5(log2FC 2.08,P=6.41E-33)、ACSL1(log2FC 1.30,P=5.80E-27)和OLAH(log2FC 2.57,P=1.49E-09)。(3)H.pylori感染AGS细胞影响脂肪酸代谢作用最显著的基因是ACSL5H.pylori感染组与对照组相比较,共培养6h、12h和24h,ACSL5 m RNA表达升高倍数均显著高于ACSL1,因此我们以ACSL5作为H.pylori介导胃癌细胞脂肪酸代谢异常关键调控分子进行后续研究。2、H.pylori感染上调胃癌细胞ACSL5表达(1)H.pylori上调胃癌细胞ACSL5表达存在时间依赖性H.pylori以MOI 100:1感染AGS及HGC27细胞,分别在感染后6h、12h、24h检测ACSL5的表达。感染后6小时,ACSL5m RNA表达和蛋白表达均开始显著升高,随着感染时间延长基因表达呈现逐渐升高的趋势。(2)H.pylori上调胃癌细胞ACSL5表达存在细菌浓度依赖性H.pylori以不同感染复数MOI(0、50、100、200)感染AGS及HGC27细胞,无论在感染后6h还是24h,ACSL5 m RNA表达以及蛋白表达随着感染复数的增加而逐渐升高。3、H.pylori感染上调ACSL5表达对胃癌细胞脂肪酸代谢的影响(1)H.pylori影响AGS细胞长链fatty acyl-Co As的生物合成H.pylori感染AGS细胞中饱和脂肪酸C12:0、C14:0、C16:0和不饱和脂肪酸C18:2、C20:4n6、C20:5n3、C22:6n3的fatty acyl-Co As生物合成均显著升高;但饱和脂肪酸C10:0、C18:0和不饱和脂肪酸C16:1、C18:1的fatty acyl-Co As生物合成变化不明显。(2)ACSL5影响AGS细胞长链fatty acyl-Co As的生物合成ACSL5敲减AGS细胞中饱和脂肪酸C12:0、C14:0、C16:0、C18:0和不饱和脂肪酸C16:1、C18:1、C18:2、C20:4n6的fatty acyl-Co As含量显著降低;饱和脂肪酸C10:0的fatty acyl-Co A含量显著升高。(3)H.pylori通过上调ACSL5表达影响AGS细胞长链fatty acyl-Co As生物合成构建转染Si RNA的AGS细胞。相比于H.pylori感染ACSL5非干预组,H.pylori感染ACSL5敲减AGS细胞C14:0、C16:0、C20:4n6的fatty acyl-Co As含量显著降低,C12:0的fatty acyl-Co As含量在两组间无显著差异。(4)H.pylori通过上调ACSL5表达影响AGS细胞能量代谢变化H.pylori感染增加ACSL5非干预的AGS细胞ATP生成(P=0.012),而H.pylori感染ACSL5敲减的AGS细胞则部分抑制ATP的生成(AGS+Hp vs AGS Si301+Hp:P=0.034,AGS+Hp vs AGS Si2183+Hp P=0.023);H.pylori感染升高ACSL5非干预的AGS细胞NADP+/NADPH比率(P=0.006),而H.pylori感染ACSL5敲减的AGS细胞则部分抑制NADP+/NADPH比率升高(AGS+Hp vs AGS Si301+Hp:P=0.038,AGS+Hp vs AGS Si2183+Hp P=0.01)。第四部分:脂肪酸代谢关键酶ACSL5对胃癌细胞生物学功能的影响及临床意义1、ACSL5对胃癌细胞生物学功能的影响(1)构建ACSL5过表达与敲减工具细胞株ACSL5过表达慢病毒感染AGS及HGC27胃癌细胞,病毒感染48h荧光效率可达80%以上,ACSL5 m RNA及蛋白表达量均BMS-907351体内实验剂量显著高于空载对照组。ACSL5 Si RNA转染AGS细胞,ACSL5 m RNA及蛋白表达量均显著降低。(2)ACSL5促进胃癌细胞增殖CCK-8增殖实验表明,ACSL5过表达的AGS、HGC27细胞增殖能力显著高于空载对照组;ACSL5敲减的AGS细胞增殖能力较空载对照组显著减弱。Ed U荧光染色增殖实验表明:ACSL5过表达的AGS及HGC27细胞增殖能力显著高于空载对照组(P=0.002,P=0.005)。ACSL5敲减的AGS细胞增殖能力较空载对照组显著减弱(Si-301 vs Si-con:P<0.001;Si-2183 vs Si-con:P=0.001)。(3)ACSL5促进胃癌细胞迁移侵袭划痕愈合实验表明:ACSL5过表达的AGS及HGC27细胞伤口愈合百分比均显著高于空载对照组(P<0.001,P=0.009),ACSL5敲减的AGS细胞伤口愈合百分比均显著低于空载对照组(Si-301 vs.Si-con:P<0.001;Si-2183 vs.Si-con:P=0.009)。Transwell迁移实验表明:ACSL5过表达的AGS及HGC27细胞发生迁移的穿膜细胞数量显著高于空载对照组(P=0.006,P<0.001),ACSL5敲减组AGS细胞发生迁移的穿膜细胞数量显著低于空载对照组(Si-301 vs.Si-con:P=0.001;Si-2183 vs.Si-con:P=0.005)。Transwell侵袭实验表明:ACSL5过表达的AGS及HGC27细胞发生基质胶侵袭的穿膜细胞数量显著高于空载对照组(P=0.015,P<0.001),ACSL5敲减的AGS细胞发生基质胶侵袭的穿膜细胞数量显著低于空载对照组(Si-301 vs.Si-con:P<0.001;Si-2183 vs.Si-con:P<0.001)。2、ACSL5组织原位表达与胃癌发病风险、临床病理参数及预后的关系(1)胃癌组织ACSL5 m RNA水平表达特征利用GEPIA数据库比较了408例胃癌组织与211例胃正常组织中ACSL5m RNA表达水平的差异,发现胃癌组织ACSL5表达显著高于胃正常组织。进一步,30对胃癌与远端正常组织ACSL5 m RNA表达配对分析结果显示,胃癌组织ACSL5表达显著高于癌旁正常组织(P=0.003),平均FC值为2.54倍。(2)ACSL5蛋白在不同胃疾病中表达特征ACSL5蛋白在细胞质中表达。胃癌组织ACSL5蛋白表达高于癌旁IM-GA(P<0.001)和远端正常组织(P<0.001)。不同胃疾病中,由NAG→IM-GA→GC,ACSL5蛋白逐渐显著升高(NAG vs.IM-GA,P=0.01;IM-GA vs.GC,P<0.001)。(3)ACSL5蛋白表达对不同胃疾病的诊断价值绘制ROC曲线,评估ACSL5表达对GC和IM-GA的诊断价值,结果表明,ACSL5表达具有良好的GC(AUC=0.853,P<0.001)和IM-GA(AUC=0.641,P=0.012)诊断价值。(4)ACSL5蛋白表达与胃癌临床病理参数的相关性ACSL5蛋白表达与H.pylori感染呈正相关(P=0.014)。ACSL5蛋白在早期胃癌中表达显著高于进展期胃癌(P=0.038),在肠型胃癌中表达显著高于弥漫型癌(P=0.038),中高分化胃癌中表达高于分化较差的胃癌(P=0.022),在T1及T2期胃癌中表达高于T3及T4期胃癌(P=0.010),在无周围神经侵犯的胃癌中表达高于有神经侵犯的胃癌(P=0.022)。(5)ACSL5蛋白表达与胃癌预后的相关性Kaplan-Meier曲线显示,ACSL5高表达与低表达的GC患者总体生存期无显著差异。研究结论:1、H.pylori感染影响胃癌患者代谢表型,与血脂、血压、血糖异常相关,与Met S发病率升高呈正相关。2、H.pylori感染影响胃癌组织和胃癌细胞代谢表型,差异代谢物主要富集于脂肪酸代谢途径。3、H.pylori以时间和浓度依赖性方式上调脂肪酸代谢关键酶ACSL5表达,介导胃癌细胞脂肪酸活化及能量代谢异常。4、脂肪酸代谢关键酶ACSL5具有促进胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的生物学功能;ACSL5表达按NAG-IMGA-GC的顺序逐渐升高,ACSL5蛋白表达可作为胃癌/萎缩性胃炎诊断标志物,与H.pylori感染及胃癌临床病理参数相关、与预后无关。