背景和目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)以渐进性多认知域受损为主要临床特征,其发病率高、防治难度大,已被列为全球需要优先解决的公共健康问题。目前,针对β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)等主要致病物质的临床试验效果欠佳,迫切需要探索其他治疗方式来阻止AD的早期神经退行性变。越来越多的证据表明,线粒体功能障碍可能是一个重要的AD防治靶点。研究显示,磁场对线粒体的多种功能具有直接调控作用。间歇性θ节律爆发磁刺激(Intermittent theta burst stimulation,iTBS)作为一种通过脉冲磁场调控神经网络活性的无创脑刺激技术,其对AD患者的多个认知域均有促进作用,是潜在的AD非药物治疗方式。铁硫簇组装蛋白1(Iron-sulfur cluster assembly 1,ISCA1)属于进化中高度保守的A型蛋白家族,在维持正常线粒体功能中发挥重要作用,并且能够响应磁刺激,提示ISCA1可能是外部磁场调控线粒体功能的重要靶点。因此,本研究拟探讨iTBS是否通过调控AD脑内线粒体功能改善认知和相关病理变化,以及ISCA1在iTBS调控AD线粒体功能障碍中的作用及机制。材料和方法1.iTBS对AD小鼠认知功能和病理变化的影响(1)iTBS对认知行为的影响:将6月龄的APP/PS1小鼠(Tg)和C57BL/6J小鼠(Wt)分为以下3组:Wt伪刺激组、Tg伪刺激组和Tg iTBS组。采用iTBS模式干预小鼠,1次/日,持续21天。在7月龄时,通过Morris水迷宫试验、旷场试验和Y迷宫试验检测小鼠的认知行为表现。(2)iTBS对AD相关病理变化的影响:行为学测试结束后,收集小鼠脑组织,采用组织学染色、免疫印迹和ELISA等方法,检测AD小鼠脑内的病理改变,主要包括Aβ沉积、Tau蛋白磷酸化、神经退行性变、突触可塑性和神经炎症。2.iTBS对AD小鼠脑内线粒体功能和神经元活性的影响(1)iTBS对AD脑内线粒体功能的影响:采用~(18)F-FDG PET检测小鼠脑内葡萄糖代谢,采用免疫组化、免疫印迹和生化分析的方法检测脑内氧化应激损伤和线粒体动力学。(2)iTBS对AD神经元活性的影响:采用电生理技术检测神经元兴奋性,在7月龄时,将小鼠快速断头取出大脑,将脑组织制备成300μm的脑片后,采用膜片钳的全细胞模式记录神经元放电情况;采用Neu N和c-FOS免疫荧光共染色检测小鼠脑内的神经元活性。3.ISCA1在iTBS调控AD线粒体功能中的作用(1)iTBS对PF-07321332ISCA1和线粒体铁硫簇组装的调控作用:在细胞实验中,采用过表达APP的SH-SY5Y细胞(SH-SY5Y-APP695),给予梯度iTBS刺激(0、150、300、600个脉冲),采用免疫印迹检测ISCA1的表达水平。在动物实验中,采用6月龄的APP/PS1小鼠,分为伪刺激组和iTBS组,iTBS模式干预小鼠,1次/日,持续21天,采用免疫印迹检测ISCA1、晚期铁硫簇组装相关蛋白和线粒体铁硫蛋白的水平。(2)ISCA1缺陷对iTBS介导的线粒体调控的影响:通过RNA干扰技术,采用si RNA-ISCA1和对照si RNA(si RNA-NC),在SH-SY5Y-APP695细胞中干扰ISCA1的表达,构建ISCA1缺陷的SH-SY5Y-APP695细胞模型。实验分组为:si NC伪刺激组、si NC iTBS组、si ISCA1伪刺激组和si ISCA1 iTBS组。iTBS模式在体外刺激细胞,1次/日,持续5天。采用免疫印迹检测晚期铁硫簇组装相关蛋白和线粒体铁硫蛋白的水平,采用Seahorse线粒体压力分析检测细胞氧化呼吸功能,采用JC-1探针(流式细胞法)检测线粒体膜电位,采用线粒体染色检测线粒体动力学。(3)ISCA1缺陷对iTBS介导的抗Aβ作用的影响:采用ISCA1缺陷的SH-SY5Y-APP695细胞模型,实验分组为:si NC伪刺激组、si NC iTBS组、si ISCA1伪刺激组和si ISCA1 iTBS组。进行5天的iTBS干预,通过ELISA检测细胞裂解物Aβ40和Aβ42水平。结果1.iTBS对AD小鼠认知功能和病理变化的影响(1)iTBS改善AD小鼠的认知障碍:与伪刺激组AD小鼠相比,经过iTBS干预的AD小鼠的认知行为缺陷明显减轻,体现为Morris水迷宫试验、旷场试验和Y迷宫试验中更好的行为学表现。(2)iTBS减轻小鼠的AD相关病理改变:与伪刺激组AD小鼠相比,经过iTBS干预的AD小鼠脑内的Aβ病理明显减轻,并伴随其他病理变化的改善,主要包括Tau蛋白磷酸化、神经退行性变、突触可塑性和神经炎症。2.iTBS对AD小鼠脑内线粒体功能和神经元活性的影响(1)iTBS改善AD脑内线粒体功能障碍:与Wt小鼠相比,7月龄AD小鼠脑内的葡萄糖摄取率明显降低,经过iTBS干预的AD小鼠脑内的葡萄糖摄取率显著增加。此外,iTBS还减轻AD小鼠脑内的氧化应激损伤,主要包括蛋白过氧化物(3-NT)和脂质过氧化物(MDA)的减少以及抗氧化系统(SOD、GSH和T-AOC)的增强。最后,iTBS还可促进AD小鼠脑内线粒体动力学平衡,主要表现为线粒体融合蛋白的表达增加和线粒体分裂蛋白的减少。(2)iTBS提升AD脑内神经元活性:与Wt小鼠相比,7月龄的AD小鼠皮层神经元的兴奋性明显降低,经过iTBS干预的AD小鼠皮层神经元兴奋性显著增加。此外,iTBS还可抑制AD小鼠海马和皮层神经元的c-FOS表达下调,从而增加神经元的活性。3.ISCA1在iTBS调控AD线粒体功能中的作用(1)iTBS调控ISCA1和线粒体铁硫簇组装通路:与Wt小鼠相比,7月龄AD小鼠脑组织的ISCA1表达水平显著降低。在SH-SY5Y-APP695细胞中,ISCA1的蛋白表达水平随iTBS刺激脉冲数的增加而逐渐升高;在AD小鼠中,iTBS显著上调小鼠脑组织的ISCA1水平。此外,iTBS还可上调AD小鼠脑组织晚期铁硫簇组装通路相关蛋白和线粒体铁硫蛋白的水平。(2)干扰ISCA1的表达消除了iTBS介导的线粒体调控:与动物研究一致,iTBS上调SH-SY5Y-APP695细胞的ISBioluminescence controlCA1、晚期铁硫簇组装通路相关蛋白和线粒体铁硫蛋白的水平;采用si RNA干扰ISCA1后,iTBS的铁硫簇组装通路调控作用消失。此外,iTBS还可提升SH-SY5Y-APP695细胞的线粒MDV3100说明书体氧化呼吸能力和线粒体膜电位,并促进线粒体融合抑制线粒体分裂,采用si RNA干扰ISCA1后,iTBS的上述作用消失。(3)干扰ISCA1的表达消除了iTBS对Aβ的抑制作用:在SH-SY5Y-APP695细胞中,iTBS降低细胞裂解物Aβ水平;采用si RNA干扰ISCA1的表达后,iTBS对Aβ的抑制作用消失。结论iTBS可能通过改善AD脑内线粒体功能障碍,减轻AD认知缺陷和相关病理变化;ISCA1参与iTBS对AD脑内线粒体功能的调控过程,是AD经颅磁刺激治疗的潜在靶点。