第一部分孕期糖尿病影响子代大鼠血管内皮功能,导致子代高血压的发生研究背景与目的:目前,高血压及其相关的并发症仍是造成我国居民死亡的首要原因。既往研究已表明,高血压是先天遗传易感性和后天环境因素相互作用的结果。近年来,人们开始关注生命早期(胚胎发育期)环境因素对子代成年期疾病的影响,在胚胎发育的关键期,遭遇不良环境因素(低蛋白饮食、感染、高糖等)刺激将对机体的器官功能产生长期乃至终生的影响,即使子代脱离不良环境其影响也难以改变。相关研究已证实,孕期不良因素刺激致胚胎发育期器官功能发生“异常程序化”,可介导子代多种成年期慢性疾病如高血压、恶性肿瘤、糖尿病等的发生。孕期血糖升高是一个重要的不良危险因素,除了给孕妇和胎儿带来不良结局如流产、产妇感染、巨大胎儿、新生儿低血糖及新生儿呼吸窘迫综合征等外,还使子代成年期慢性疾病,特别是高血压的发生率显著增加,其发生风险增加1.78倍。同时相关动物实验也表明,孕期糖尿病可引起子代血压升高。我们前期已发表的相关研究也发现,孕期糖尿病可致子代肾脏G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)激活,进而引起肾脏多巴胺D_1受体介导的尿钠排泄功能受损,导致子代血压升高。机体血压主要受肾脏、外周血管及大脑中枢的调控,是否外周血管异常的收缩与舒张参与了孕期糖尿病致子代高血压的发生过程及其相关机制,尚不清楚。因此,我们提出假设:孕期糖尿病可致子代大鼠肠系膜动脉内皮功能受损及血压升高。本部分主要针对孕期糖尿病致子代大鼠高血压的外周血管内皮功能机制进行探讨。研究方法:成年雌性SD大鼠(220～250g)与雄性大鼠按1:1合笼后,当见孕栓者定为妊娠第0天,将其随机分为孕期对照组、孕期糖尿病组和孕期糖尿病胰岛素干预组。孕期对照组第0天给予腹腔Citrate buffer(1 m L);孕期糖尿病组给予腹腔注射STZ(35mg/kg);孕期糖尿病胰岛素处理组在腹腔注射STZ的基础上,同时于妊娠第0天,皮下埋入胰岛素微量泵,持续泵入胰岛素。孕期对照子代和孕期糖尿病子代于24周开始分别给予溶剂处理(腹腔注射生理盐水,1 ml/day)、4-PBA处理(内质网应激抑制剂,腹腔注射,1 g/kg/day)和Tudca处理(内质网应激抑制剂,腹腔注射,150 mg/kg/day),共计6周。分别观察子代大鼠以下指标:(1)采用鼠尾测压持续监测血压情况;(2)采用HE染色检测子代大鼠胸主动脉和肠系膜动脉组织形态学改变;(3)通过血管张力实验检测子代大鼠肠系膜动脉基础状态下以及孵育一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(100μM)后对苯肾上腺素(PE)诱导的血管收缩反应;(4)通过血管张力实验检测子代大鼠肠系膜动脉基础状态下以及孵育一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(100μM)或AMPK激动剂(A769662,30μmol/L)、或AMPK抑制剂(Compound C,5μmol/L)、或PPARδ激动剂(GW1516,100 nmol/L)、或PPARδ抑制剂(GSK0660,500 nmol/L)后对乙酰胆碱(Ach)诱导的血管内皮依赖性舒张反应;(5)通过血管张力实验检测子代大Decitabine鼠肠系膜动脉对硝普钠(SNP)诱导的血管内皮非依赖性舒张反应;(6)通确认细节过DHE染色检测子代大鼠肠系膜动脉活性氧自由基水平;(7)通过Western-blot检测子代大鼠肠系膜动脉原代内皮细胞p-AMPKα、PPARδ、内质网应激标志物(p-PERK、p-IRE1、CHOP、p-e IF2α和ATF-6)、p-e NOS表达水平;研究结果:(1)与孕期对照子代大鼠比较,孕期糖尿病子代大鼠血压升高和肠系膜动脉内皮舒张功能受损,且内皮舒张功能受损时间早于血压升高。(2)内质网应激激活是孕期糖尿病子代肠系膜动脉内皮舒张功能受损的原因。与孕期对照子代比较,孕期糖尿病子代内质网应激标志物(p-PERK、p-IRE1、CHOP、p-e IF2α和ATF-6)和活性氧自由基显著增强;肠系膜动脉内皮细胞NO生成和p-e NOS表达水平减少;肠系膜动脉PE诱导的收缩增强和Ach诱导的舒张功能减弱。给予抗内质网应激处理6周,可显著降低孕期糖尿病子代大鼠内质网应激相关标志物表达水平,减少活性氧自由基,增加肠系膜动脉内皮细胞p-e NOS表达水平和NO生成,降低肠系膜动脉PE诱导的收缩和增强Ach诱导的舒张功能,进一步降低血压。(3)孕期糖尿病可致子代肠系膜动脉内皮细胞p-AMPKα和PPARδ表达显著下调。AMPK激动剂(A769662)或PPARδ激动剂(GW1516)可改善孕期糖尿病子代大鼠肠系膜动脉受损的内皮依赖性舒张,同时逆转内质网应激诱导剂(Tuni)孵育孕期对照子代大鼠肠系膜动脉后增加的内质网应激、活性氧自由基以及受损的内皮依赖性舒张;PPARδ抑制剂(GSK0660)减弱AMPK激动剂(A769662)的上述作用,然而AMPK抑制剂(Compound C)并不能抑制PPARδ激动剂(GW1516)的上述作用。上述结果表明AMPK/PPARδ是内质网应激的上游,AMPK/PPARδ信号下调是触发孕期糖尿病子代大鼠内质网应激、血管内皮功能受损的重要原因。(4)对孕期糖尿病给予胰岛素干预,可显著增加子代肠系膜动脉内皮细胞p-AMPKα和PPARδ表达水平,降低内质网应激,改善受损的内皮舒张功能,进一步降低血压。研究结论:孕期糖尿病下调子代肠系膜动脉内皮细胞p-AMPKα/PPARδ信号,并增强内质网应激及相关的氧化应激,导致内皮依耐性舒张功能受损,最终诱发子代高血压的发生。第二部分Sirt3在孕期糖尿病致子代大鼠高血压跨代遗传中的作用研究背景与目的:孕期糖尿病可引起子代高血压,但是否可引起高血压跨代遗传,尚无相关研究报道。前期研究发现孕期糖尿病可引起子代外周交感神经显著激活。室旁核作为最重要的中枢心血管调控中心,可通过调节外周交感神经活性,发挥调控血压的作用,其中室旁核小胶质细胞激活,进而触发下游炎症信号,是高血压发生的重要神经源性基础。小胶质细胞激活与线粒体功能障碍相关,Sirt3是调控线粒体功能是重要因子。是否Sirt3参与了孕期糖尿病致子代高血压的跨代遗传,尚有待研究。因此,我们提出假设,小胶质细胞Sirt3下调,引起线粒体功能障碍,进而激活小胶质细胞,导致外周交感神经活性增加,是孕期糖尿病子代高血压跨immune deficiency代遗传发生的重要机制。研究方法:成年雌性SD大鼠(220～250g)与雄性大鼠按1:1合笼后,当见孕栓者定为妊娠第0天,将其随机分为孕期对照组和孕期糖尿病组。孕期对照组第0天给予腹腔Citrate buffer(1 m L),孕期糖尿病组给予腹腔注射STZ(35 mg/kg)。将孕期糖尿病的子一代(F_1)雌性与孕期对照子一代(F_1)雄性合笼,得到孕期糖尿病子二代(F_2),并按此法得到F3代。将24周龄孕期对照和孕期糖尿病相应子代(F_1和F_3代)大鼠随机分为孕期对照子代溶剂组、孕期对照子代CMT-3(小胶质细胞激活抑制剂)干预组、孕期糖尿病子代溶剂组、孕期糖尿病子代CMT-3干预组。溶剂组和干预组分别从24周开始通过侧脑室给予输注人工脑脊液(a CSF,0.25μL/h)和CMT-3(3.5μg/h),直至30周。同时孕期对照和孕期糖尿病子代(F_1和F_3代)分别从24周开始通过侧脑室注射腺相关病毒即高表达空载体组/AAV-NC和腺相关病毒高表达Sirt3/AAV-Sirt3。分别检测以下指标(1)采用无创鼠尾和植入子检测子代体外和体内血压情况;(2)采用放射免疫试剂盒检测子代外周血去甲肾上腺素(NE)水平;(3)采用频谱分析法评估心率变异性,计算低频与高频的比值(LF/HF);(4)通过DHE染色检测子代大鼠下丘脑室旁核活性氧自由基水平;(5)通过化学发光检测小胶质细胞ATP含量和q PCR检测mt DNA拷贝数;(6)通过Western-blot检测室旁核小胶质细胞Iba1和Sirt3表达情况。研究结果:(1)孕期糖尿病可引起子代外周交感神经活性增加(外周血NE水平和LF/HF比值增加)和血压升高,进一步传代发现,此高血压表型可跨代遗传到F3代。(2)与孕期对照子代大鼠比较,中枢室旁核小胶质细胞在孕期糖尿病子代(F_1-F_3代)显著激活,抑制小胶质细胞激活,可降低外周交感神经活性和血压。(3)与孕期对照子代大鼠比较,孕期糖尿病相应子代(F_1-F_3代)小胶质细胞Sirt3表达显著下调和线粒体功能障碍(ATP含量和mt DNA拷贝数减少);过表达Sirt3可改善孕期糖尿病子代线粒体功能即增加ATP含量和mt DNA拷贝数减少,抑制小胶质细胞激活,降低外周交感神经活性和血压。研究结论:孕期糖尿病可通过下调子代室旁核小胶质细胞Sirt3表达,引起线粒体功能障碍,触发小胶质细胞激活,进而增加外周交感神经活性,导致高血压的跨代遗传。