研究背景:多发性硬化(Multiple selleck NMRsclerosis,MS)的发病机制仍不清楚,也缺乏有效的治疗药物。目前已证明活化的小胶质细胞(Microglia,MG)向促炎型(MG1)极化加重了炎性脱髓鞘损伤,向神经保护型(MG2)极化则可抑制炎症反应、促进髓鞘生成、减轻轴索损伤。AXL是受体酪氨酸激酶TAM家族的一员,研究发现AXL与其配体Gas6结合启动下游级联反应,调节小胶质细胞功能,但AXL对MS中小胶质细胞极化的调控尚未见相关报道。本课题前期研究发现AXL可作为免疫负调控因子在MS中发挥保护作用,且MG2型细胞比例在MS病程恢复期明显上调,提示AXL可能作为MS小胶质细胞极化的关键调控因子发挥作用。另高通量药物筛选是目前靶向药物开发中广泛应用的研究方法,具有研究周期短、操作简便、实用性强等优势。本课题拟探讨MS体内和体外模型中AXL的表达变化、AXL调控MG极化的分子机制并筛选靶向AXL的药物,为MS的机制探究和药物开发提供证据支持。研究目的:(1)明确AXL是否为MS病理生理过程中的关键免疫负调控因子;(2)探讨AXL能否在体内外调节小胶质细胞极化并明确其分子机制;(3)基于FDA药物库筛选靶向AXL并抑制EAE炎性脱髓鞘的药物,初步探究其作用机制。研究方法:第一部分明确AXL对MS小胶质细胞极化的影响。构建EAE模型小鼠,模拟MS急性期病程变化。使用DIA定量蛋白质组学技术检测EAE模型中的差异表达蛋白。基因水平观察EAE病程脊髓组织中AXL的动态表达水平;免疫荧光共定位脊髓组织中AXL与MG1/MG2表型的表达,同时体外观察BV2细胞不同极化状态下AXL的表达,并评估AXL对小胶质细胞极化表型的影响。CRISPR/Cas9技术构建AXL~(-/-)小鼠并诱导EAE,观察AXL基因敲除对EAE小鼠严重程度的影响。进一步使用DIA定量蛋白质组测序挖掘AXL敲除前后EAE模型小鼠脊髓中差异表达的下游信号分子。第二部分探讨AXL调控小胶质细胞极化的分子机制。在BV2细胞中使用慢病毒转染构建AXL过表达和敲减稳转株,体外观察AXL对BV2细胞中炎症因子表达的影响、MG1/MG2表型的影响、吞噬功能及细胞形态的影响,并验证蛋白质组学结果中AXL下游差异蛋白的表达,以及AXL通过调控关键蛋白对小胶质细胞极化的影响。体内探讨AXL对EAE模型脊髓组织中小胶质细胞极化的影响。构建AXL~(-/-)小鼠,观察AXL敲除对EAE小鼠神经炎症及脱髓鞘程度的影响、脊髓组织中小胶质细胞极化的影响以及脊髓中AXL下游差异蛋白表达的影响。提取EAE小鼠原代小胶质细胞,观察AXL对原代小胶质细胞极化的影响。使用AXLY294002生产商L特异性配体重组Gas6蛋白上调AXL表达,体内观察激活AXL对EAE小鼠疾病严重程度的影响。第三部分基于FDA药物库筛选上调AXL治疗MS的药物及疗效观察。质粒转染构建AXL-GFP荧光报告基因的BV2细胞药筛模型,使用高通量药物筛选,从FDA批准的2769种化合物库中筛选能够显著上调AXL并可维持BV2细胞活力的化合物,分别通过初筛、复筛、文献库比对,初步确定候选药物。将候选药物分子结构与AXL蛋白三级结构进行虚拟分子对接,根据其与AXL的结合能力,选择结合效果佳的化合物进行初步疗效观察。确定候选药物上调AXL并促进BV2细胞增殖的最佳干预浓度与时间,观察候选药物对BV2细胞炎症因子Ocular genetics表达、极化表型、吞噬功能及细胞形态、细胞周期、凋亡及线粒体形态和功能的影响。选择体外效果确切的两种候选药物进行体内初步疗效观察。根据体内干预结果最终确定疗效最显著的一种作为目标药物,探讨目标药物上调AXL并促进BV2细胞向MG2型极化的作用机制。在体内使用重组Gas6蛋白上调AXL表达,比较目标药物与Gas6改善EAE的效果,以及敲除AXL后目标药物对EAE小鼠疗效的影响。研究结果:第一部分AXL可促进体内外小胶质细胞向MG2型极化。EAE模型可经典模拟MS的炎性脱髓鞘病理特征。蛋白质组学结果显示,EAE模型中AXL具有显著差异表达。随着EAE病程进展,AXL表达逐渐升高,21天达峰后趋于平稳。荧光共定位结果显示,脊髓组织中AXL与MG2型标记物CD206表达趋势基本一致。体外研究表明,AXL在MG1型BV2细胞中表达降低,MG2型中表达升高,而且AXL可显著促进BV2细胞从促炎MG1型向神经保护MG2型转变。体内敲除AXL可明显加重EAE小鼠严重程度,细胞内信号传导抑制因子SOCS3及JAK2/STAT信号通路可能是EAE模型小鼠中AXL调控MG极化的关键信号蛋白。第二部分AXL可通过上调SOCS3抑制JAK2/STAT1信号通路,促进小胶质细胞MG2型极化,减轻EAE模型小鼠炎性脱髓鞘病变。体外研究结果表明,AXL可显著上调BV2细胞中的抑炎因子TGF-β、IL-10,下调促炎因子TNF-α、IL-1β的表达。AXL可促进BV2细胞和EAE模型小鼠脊髓组织中小胶质细胞向MG2型极化,并增强其吞噬功能。蛋白质组学的结果验证提示,AXL下游SOCS3、JAK2、STAT1具有显著差异表达,AXL可通过上调SOCS3抑制JAK2/STAT1信号减轻BV2细胞炎症反应。体内研究结果表明,敲除AXL明显加重了EAE小鼠神经炎症及脱髓鞘改变、抑制了EAE小鼠脊髓中小胶质细胞向MG2型极化,并通过抑制SOCS3激活JAK2/STAT1信号通路。AXL可显著促进EAE小鼠原代小胶质细胞向MG2型极化,体内使用Gas6蛋白激活AXL后明显减轻了EAE的临床症状评分、神经炎症及脱髓鞘。而AXL敲除可拮抗Gas6对EAE模型小鼠的保护作用。第三部分白桦脂醇(Betulin)是小胶质细胞中可显著上调AXL并发挥炎性负调控作用的化合物。初筛和复筛初步确定了3种化合物,分子对接排除了一种与AXL结合欠佳的药物,最终选取Betulin和Clofibric进行疗效观察。Betulin和Clofibric可促进BV2向MG2型极化和形态转变、抑制炎症反应、增强吞噬功能、延长S期、抑制凋亡、改善线粒体结构。体内研究结果表明,Betulin改善EAE的疗效优于Clofibric Acid。Betulin在1μM以内呈浓度依赖性促进BV2细胞MG2型极化、抑制促炎因子表达、促进抑炎因子表达、增强BV2细胞吞噬功能。并通过上调AXL/SOCS3抑制JAK2/STAT1信号通路发挥治疗作用。体内机制研究表明,Betulin可上调AXL促进小胶质细胞MG2型转化缓解EAE小鼠病情,AXL基因敲除可拮抗Betulin的上述保护作用。研究结论:(1)AXL是MS治疗中具的关键分子靶点;(2)AXL可通过上调SOCS3抑制JAK2/STAT1信号通路,促进小胶质细胞MG2型极化,减轻EAE模型小鼠炎性脱髓鞘损伤;(3)白桦脂醇(Betulin)可显著上调小胶质细胞中的AXL并改善EAE,是MS研究中具有前景的化合物。