背景急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一种早期分化受阻、能够侵犯骨髓、血液和髓外部位的淋巴样细胞恶性增殖性肿瘤,在儿童和成人中均可发病,但是主要发生在儿童,发病高峰在1到4岁,约占该年龄段所有肿瘤的80%。尽管在过去的30年里,诊疗技术的不断提升使当代儿童ALL的5年总生存率普遍可达90%以上,但复发/难治性ALL患儿的预后仍然很差。BCL-2抑制剂是一种新型的抗肿瘤药物,主要通过直接靶向促进细胞存活的BCL-2蛋白来杀伤肿瘤细胞,其具备的高效性、特异性和作为口服药物的良好的生物利用度使之在多种血液系统恶性肿瘤中得到了广泛应用。目前,Venetoclax已被美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)。在 ALL 中,Venetoclax的抗肿瘤活性也在部分亚型中得到证实。然而,随着BCL-2抑制剂的广泛应用,获得性耐药也随之出现,因此,寻找新的治疗靶点来克服耐药性是提升临床治疗效果和改善患者预后的重要策略,而确定药物的耐药机制以及探索新的治疗靶点则在很大程度上依赖于肿瘤耐药细胞系模型的构建。因此,本研究旨在利用急性 B 淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)细胞系 RS4;11构建对BCL-2抑制剂NavBMN 673itoclax和Venetoclax耐药的细胞系模型,再结合RNA-sequencing(RNA-seq)技术及 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9(CRISPR/Cas9)技术来研究诱发 B-ALL 细胞对BCL-2抑制剂耐药的机制。方法采用小剂量低浓度递增、间歇诱导的方法构建耐药细胞系,以低浓度10nmol/L Navitoclax和1 nmol/L Venetoclax作为诱导的起始培养浓度,经过6个月的间歇培养,通过MTT法检测不同药物浓度下RS4;11亲本细胞系和耐药细胞系的活率,从而确认对BCL-2抑制剂耐药的细胞系RS4;11 Navitoclax-Resistant(RS4;11 N-R)细胞系和RS4;11 Venetoclax-Resistant(RS4;11 Panobinostat体内实验剂量V-R)细胞系的成功构建。之后采用流式细胞术检测Navitoclax和Venetoclax对RS4;11亲本细胞系和耐药细胞系细胞凋亡的影响,采用EDU检测Navitoclax和Venetoclax对RS4;11亲本细胞系和耐药细胞系细胞周期的影响。为验证耐药细胞系的耐药机制是否与MCL-1的过表达有关,采用MTT检测亲本细胞系和耐药细胞系对MCL-1抑制剂S63845的敏感性,通过细胞凋亡和细胞周期实验验证MTT检测的结果。采用western blot实验检测BCL-2家族抗凋亡蛋白的表达。对RS4;11耐药细胞系和亲本细胞系进行RNA-seq,通过对测序结果进行分析,得到显著表达的差异基因,随后进行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析,初步探索对 BCL-2 抑制剂可能的耐药机制。通过RT-qPCR和Western blot对显著表达的差异基因从mRNA表达水平和蛋白表达水平进行验证。利用CRISPR/Cas9技术敲除显著表达的差异基因,随后利用western blot实验检测目的基因是否成功敲除,利用MTT实验检测基因敲除对耐药细胞系耐药性的影响。结果:Navitoclax 和 Venetoclax 的 MTT 实验结果证明了 RS4;11 N-R 和 RS4;11 V-R 细胞系的成功构建。细胞凋亡和细胞周期实验结果表明,亲本细胞系被Navitoclax和Venetoclax显著抑制(p<0.001),而耐药细胞系的凋亡和增殖基本不受药物影响。MCL-1抑制剂S63845的MTT实验结果表明,相比于亲本细胞系,2种耐药细胞系对S63845更加耐药。而对BCL-2家族抗凋亡的BCL-2、BCL-XL和MCL-1蛋白的western blot结果发现,这些蛋白的表达水平在亲本和耐药细胞系中没有显著性差异。RNA-seq结果显示,E 1Abindingproteinp300(p300,EP300)在耐药细胞系中的表达较亲本细胞系升高,而随后进行的western blot和RT-qPCR结果则分别从蛋白水平上和mRNA水平上证明了耐药细胞系中存在EP300的表达上调。通过western blot实验我们证明了 CRISPR/Cas9技术成功将2种诱导构建的对BCL-2抑制剂耐药的细胞系(RS4;11 N-R和RS4;11 V-R细胞系)及2种天然对BCL-2抑制剂耐药的细胞系(Reh和Nalm6细胞系)中的EP300基因敲除,并且MTT实验结果显示,EP300基因敲除后,上述4种对BCL-2抑制剂耐药的细胞系对BCL-2抑制剂(Navitocliatrogenic immunosuppressionax和 Venetoclax)、BCL-XL 抑制剂(A1331852)和 MCL-1 抑制剂(S63845)的敏感性都提高了,提示引起B-ALL细胞系对BCL-2抑制剂耐药的机制可能与EP300的表达上调有关。结论本研究通过构建体外耐药细胞系模型,结合RNA-seq测序技术和CRISPR/Cas9技术确定了EP300的过表达可能是导致B-ALL细胞系对BCL-2抑制剂耐药的机制。背景急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是儿童最常见的恶性血液病,尽管危险度分层诊疗方案的实施和治疗方案的优化使当代儿童ALL的治愈率已超过90%,然而仍有相当多的患儿出现化疗耐药和肿瘤复发。由于化疗药物主要通过诱导细胞凋亡发挥抗白血病作用,因此,白血病细胞抗凋亡活性的增加是最常见的复发机制之一。铁死亡作为一种铁依赖性细胞死亡,由脂质过氧化产物的异常积累引起。由于它不同于其他类型的程序性死亡,例如细胞凋亡、坏死性凋亡和自噬性细胞死亡,因此,诱发肿瘤细胞的铁死亡成为了新的肿瘤治疗策略,特别是对于对传统疗法反应不佳的侵袭性、复发性恶性肿瘤。研究表明,诱导铁死亡可能是治疗复发ALL的有效方法,因此,我们的研究旨在确定儿童复发性ALL预后相关的铁死亡相关基因(ferroptosis-related genes,FRGs)并构建预后风险模型。方法我们从 Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Treatments(TARGET)数据库获得256个儿童ALL患者的临床信息和基因表达数据,并将患儿分为复发组和非复发组。从铁死亡FerrDb数据库中获得268个FRGs,结合复发组和非复发组儿童ALL患者之间的差异表达基因,从而得到差异表达的FRGs(differentially expressed FGRs,DEFRGs)。随后,将具有完整临床信息的191个患者样本随机分为训练组(n=96)和验证组(n=95),对训练组进行DEFRGs的单因素Cox回归分析和Lasso回归分析来确定预后相关的DEFRGs,随后进行多因素Cox回归分析和风险模型的构建,根据构建的风险模型将训练组分为高、低风险两组,并同时在验证组和整个样本组中来验证风险模型的准确性。比较高、低风险组中的差异表达基因并对其进行 Gene Ontology(GO)和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析,以对高、低风险组之间差异表达基因的功能进行分析。结果我们从256个儿童ALL样本中筛选了 43个DEFRGs,并且这些基因在复发组中显著上调。对训练组使用单因素Cox分析筛选了 28个与总生存(overall survival,OS)相关的DEFRGs。然后,Lasso回归分析筛选出8个预后相关的基因并用于构建预后风险模型,而进一步的多因素Cox回归分析确定了出5个最佳的预后基因(MT1G、GPT2、TFAP2C、GCLM和HSBP1)。对训练组、验证组和整个样本组中的高、低风险组计算风险评分和进行生存分析,结果显示,在不同分组中高风险评分均与不良预后相关。受试者工作特征(receiver operating characteristic curve,ROC)曲线显示出良好的预测准确性(训练组、验证组和整个样本组的预后模型的AUC值在1年时分别为0.817、0.87和0.918,在3年时分别为0.652、0.770和0.782,在5年时分别为0.743、0.825和0.851)。因此,我们构建的预后风险模型在训练组、验证组和整个样本组中得到了成功验证。对高、低风险组进行的差异分析和富集分析则提示ALL患者的预后与免疫活性相关。对高、低风险组进行的单样本基因富集分析(single-sample gene set enrichment analysis,ssGSEA)的结果则表明,在高风险组中存在免疫细胞浸润和免疫相关通路的激活。结论在儿童复发性ALL中构建的FRGs的预后风险模型能够有效地将患者分为高风险和低风险两组并准确预测患者预后,并且高、低风险组预后的差异可能与肿瘤的免疫浸润相关,这对于预测临床ALL患者预后和优化个体化治疗具有重要意义。