研究背景:糖尿病是冠心病经皮冠状动脉介入术(PCI)后血管内再狭窄的独立危险因素。既往研究表明,肥胖相关蛋白(FTO)可影响糖尿病血管内膜增生,但其具体分子机制尚未完全阐明。目的:本研究拟通过感染慢病毒载体干预FTO的表达,在大鼠原代血管平滑肌细胞(VSMCs)与颈动脉血管组织中探讨下调FTO对VSMCs迁移功能的影响,为防治糖尿病血管内膜增生提供新的治疗靶点。方法:(1)细胞实验:将原代培养的大鼠VSMCs随机分为4组:正常对照组(NG组)、高糖组(HG组)、阴性慢病毒组(LV-NC-RNAi+HG组)、FTO下调组(LV-Fto-RNAi+HG组)。以MOI=25感染慢病毒至VSMCs 3 d后,使用荧光显微镜观察慢病毒感染情况;使用Transwell小室实验、STM2457分子量划痕实验及迁移相关蛋白检测评估VSMCs的迁移能力;使用Western blot检测FTO、LANCL2、AKT、p-AKT蛋白表达水平;使用m~6A dot blot实验检测总RNA的m~6A甲基化丰度;使用Me RIP-q PCR实验检测LANCL2m RNA的m~6A甲基化水平。(2)动物实验:将60只健康雄性SD大鼠按随机数字法分为正常大鼠假手术组(Nor+Sham组)、正常大鼠+颈动脉球囊损伤组(Nor+Injury组)、糖尿病大鼠+颈动脉球囊损伤组(DM+Injury组)、糖尿病大鼠+颈动脉球囊损伤+阴性慢病毒组(DM+Injury+LV-NC-RNAi组)、糖尿病大鼠+颈动脉球囊损伤+FTO下调组(DM+Injury+LV-Fto-RNAi组)。糖尿病组大鼠给予高糖高脂饲料喂养4 w,小剂量链脲佐菌素(STZ,20 mg/kg)单次腹腔注射3 d后,尾静脉采血检测大鼠随机血糖以评价糖尿病大鼠造模情况(血糖值≥15 mmol/L即认为造模成功)。继续给予高糖高脂饲料喂养2 w后行颈动脉球囊损伤术,术后夹闭颈总动脉与颈内动脉并永久结扎颈外动脉,于损伤non-medical products的颈总动脉节段局部感染慢病毒或注射生理盐水20 min后,恢复颈总动脉至颈内动脉血流,以此构建糖尿病大鼠颈动脉球囊损伤模型。正常组大鼠予以普食喂养6 w后行颈动脉球囊损伤,Nor+Sham组暴露颈总、颈内及颈外动脉后不予以球囊损伤,余操作同手术组。使用H&E染色检测血管内膜增生情况;使用Western blot检测FTO、LANCL2、AKT、p-AKT以及MMP9蛋白表达水平。结果:(1)细胞实验:(1)高糖刺激上调VSMCs中FTO的表达并下调m~6A甲基化水平:与0 h相比,高糖刺激VSMCs 48 h时FTO表达升高最为显著,且m~6A dot blot检测发现,与NG组相比,HG组的m~6A甲基化水平整体降低(P<0.05)。(2)成功感染慢病毒至大鼠原代VSMCs:与Control组相比,LV-NC-RNAi+HG组和LV-Fto-RNAi+HG组可观察到大量携带绿色荧光的VSMCs。(3)下调FTO抑制高糖诱导的VSMCs迁移:使用Western blot检测迁移相关蛋白发现,与NG组相比,HG组明显上调了MMP9的蛋白水平,与LV-NC-RNAi+HG组相比,LV-Fto-RNAi+HG组显著下调了MMP9的蛋白水平(P<0.05)。Transwell小室和划痕实验结果发现,HG组发生迁移的细胞数及迁移率显著升高,下调FTO明显抑制了高糖刺激引起的细胞迁移(P<0.05)。(4)下调FTO抑制高糖诱导的VSMCs中LANCL2/AKT信号通路活化:高糖刺激促进了LANCL2的表达与AKT磷酸化,下调FTO则显著抑制了高糖诱导的LANCL2/AKT信号通路活化,该效应在应用LANCL2激动剂BT-11后被逆转(P<0.05)。(5)FTO在VSMCs中调控LANCL2 m RNA的m~6A去甲基化修饰:Me RIP-q RCR检测发现,下调FTO后,LANCL2m RNA的m~6A甲基化修饰丰度显著升高(P<0.05)。(2)动物实验:(1)成功构建大鼠颈动脉球囊损伤模型:与Nor+Sham组相比,Nor+Injury组血管内膜面积、内膜/中膜面积比明显升高(P<0.05)。(2)下调FTO改善糖尿病大鼠颈动脉球囊损伤后血管内膜增生:H&E染色结果显示,与DM+Injury+LV-NC-RNAi组相比,DM+Injury+LV-Fto-RNAi组血管内膜面积、内膜/中膜面积比明显降低(P<0.05)。(3)下调FTNavitoclax体内O抑制糖尿病大鼠球囊损伤后颈动脉内膜组织中迁移相关蛋白水平:与DM+Injury+LV-NC-RNAi组相比,DM+Injury+LV-Fto-RNAi组血管组织中MMP9的蛋白水平降低(P<0.05)。(4)下调FTO抑制糖尿病大鼠球囊损伤后颈动脉内膜组织中LANCL2/AKT信号通路活化:与Nor+Injury组相比,DM+Injury组血管组织中LANCL2、p-AKT的蛋白水平升高,总AKT水平无明显改变;与DM+Injury+LV-NC-RNAi组相比,DM+Injury+LV-Fto-RNAi组血管组织中LANCL2、p-AKT的蛋白水平降低,总AKT水平亦无明显改变(P<0.05)。结论:下调FTO可促进LANCL2 m RNA的m~6A甲基化,降低LANCL2的表达,从而抑制AKT信号通路介导的VSMCs迁移,拮抗糖尿病诱导的血管内膜增生。