背景:黄曲霉及其代谢产物是严重威胁食品及饲料安全,危害人畜生命健康的污染物。生防菌和抑菌蛋白的筛选鉴定为安全有效的抑制黄曲霉污染提供了新方法。解淀粉芽孢杆菌是一种极具发展前景的真菌拮抗菌,其代谢产物被确定含有多种抗菌活性物质,能对黄曲霉正常生命活动产生显著影响。本试验室在之前的研究中得到一株解淀粉芽孢杆菌B10,且已证实其无菌发酵上清液对黄曲霉有明显抑制活性。目的意义:分离纯化并确定解淀粉芽孢杆菌B10中具体抗黄曲霉活性成分,明确其生化特性及抑菌作用方式。为采用生物防控技术防控饲料中黄曲霉污染提供了新的思路和理论依据,为进一步防治真菌毒素中毒病及临床生产应用奠定基础。方法:以解淀粉芽孢杆菌B10为研究对象,用硫酸铵梯度沉淀其无菌发酵上清液中的蛋白成分,并通过DEAE阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱对蛋白粗提液进行分离纯化。将最优抑菌组分进行蛋白质质谱鉴定,初步筛选分析出可能具有黄曲霉抑制效果的活性蛋白。之后设计引物Whole Genome Sequencing从B10中扩增活性蛋白基因,构建pET-28a重组载体并通过Trans5α及BL21感受态细胞进行目的蛋白克隆表达。通过Prot Param工具、SDS-PAGE及灰度值分析等操作,对目的蛋白进行生物信息学分析、最适诱导表达条件探索及表达形式的鉴定。再对目的蛋白进行亲和层析纯化,并通过平板抑菌试验检验其抑菌活性。梯度selleck化学稀释法得到活性蛋白最小抑菌浓度(MIC)后通过监测吸光度变化情况探究不同温度、p H、紫外照射时长、金属离子及有机溶剂对活性蛋白抑菌R428率的影响。最后收集经活性蛋白处理的黄曲霉,通过扫描及透射电镜观察、细胞膜通透性及线粒体膜电位变化、ROS水平及CAT、SOD活性检测探究二者黄曲霉抑制方式。结果:1.80%浓度硫酸铵制备的蛋白粗提液具有最佳抑菌效果,在纯化后的最优抑菌组分中初步鉴定出多种可能抑制黄曲霉的活性蛋白。2.扩增到6种目的蛋白基因并成功进行了克隆表达。B10-SP及B10-CWH的最佳诱导条件为37℃5h;B10-Xyl为30℃8h;B10-LCI为16℃16h;B10-CBP及B10-Glu为25℃12h。并且各目的蛋白的表观分子量与预测分子量均较为接近。其中仅B10-LCI及B10-Glu以可溶性蛋白形式表达,且具有对黄曲霉的抑制活性。抑菌圈半径分别为1.14 cm及1.17 cm,相较于未纯化组及B10粗提蛋白组具有更加清晰明显的抑菌效果。3.B10-Glu和B10-LCI MIC值分别为0.94μg/m L及0.96μg/m L。B10-Glu在37℃、p H=7.0、K~+及EDTA存在条件下抑菌效果最佳;B10-LCI在45℃、p H=9.0及EDTA处理下抑制效果最好。且二者在紫外照射30 min后仍具有较高的抑菌活性。此外B10-Glu及B10-LCI均能破坏黄曲霉菌丝形态,抑制菌丝生长及孢子形成,并使黄曲霉细胞壁膜结构发生明显改变,导致细胞质壁分离、细胞内容物流失,线粒体结构损伤、功能紊乱,促进ROS积累,降低抗氧化水平。结论:从解淀粉芽孢杆菌B10中纯化、鉴定并克隆表达出两种抗黄曲霉活性物质,1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(B10-Glu)及抗菌肽LCI(B10-LCI)。二者均能抑制黄曲霉菌丝生长及孢子形成,破坏黄曲霉细胞正常结构并影响其ROS及抗氧化水平。MIC分别为0.94μg/m L及0.96μg/m L。B10-Glu在37℃、p H=7.0、K~+及EDTA存在下表现出较高的抑菌活性,B10-LCI则是在45℃、p H=9.0、EDTA存在时黄曲霉抑制活性最佳,且二者均对紫外线有较强耐受性。