目的:本研究前期细胞及动物实验显示CYP2J是麦冬皂苷D(OPD)发挥心血管保护作用的潜在关键靶点,但CYP2J究竟在其中发挥多大作用以及在整体动物水平的反向药理学验证效果如何仍需要探索,这也是本研究的科学问题所在。结合之前的发现OPD能够保护低氧导致的心肌损伤,同时OPD能够强效诱导CYP2J并与其存在直接相互作用,但能否在整体动物水平上验证OPD发挥作用与CYP2J靶点直接相关仍需要探索。因此本研究旨在利用CYP2J KO大鼠模拟低氧条件下心肌损伤模型,比较野生型与CYP2J KO大鼠在心肌损伤干预的差异,进一步证明OPD发挥抗缺氧心肌保护作用与CYP2J靶点直接相关,有助于从分子靶点更深入的诠释中药麦冬及其重要成分OPD的心血管保护作用,阐明中药麦冬心血管保护作用新的可能机制的同时有助于以CYP2J3为靶点筛选更多具有心血管保护作用的中药或天然活性小分子。方法:1.OPD的常氧抗疲劳作用的研究在常氧条件下建立小鼠游泳疲劳模型,给药方式为:小鼠预防七天给药OPD(20mg/kg,40mg/kg,60mg/kg,ig),测定不同给药组小鼠负重游泳时间Biomass burning反映其抗疲劳效果,试验结束后取材,检测小鼠的抗疲劳生化指标(CK、UREAL、肝糖原、血乳酸等)。2.OPD对模拟低氧的野生型大鼠和CYP2J KO大鼠的心肌损伤保效应与作用机制研究模拟海拔6000m缺氧72小时构建急性低压低氧大鼠应激模型,分别进行两批大鼠实验,第一批OPD单剂量预防灌胃给药,给药浓度为OPD(20mg/kg,ig);第二批OPD多剂量预防灌胃给药,给药浓度为OPD(10mg/kg,20mg/kg,40mg/kg,ig),同时附加低氧条件下大鼠跑步负荷实验,进一步考察低氧下的抗疲劳效果。实验结束后取材,检测大鼠的血常规(RBC),血液生化指标(c Tn、MYO、CK、CKMB、AST、LDHI、HDLC、LDLC等),氧化应激水平指标(SOD、MDA、GSH),Western Blot法检测内质网应激相关分子HIF-1a、PERK、ATF4、ATF6、Bax、Bcl-2、及线粒体相关分子MTCO-1、SDHB、NDUFB8、UQCRC2的蛋白表达,q PCR法检测HIF-1a、ATF4、CHOP、CYP2J3的基因表达,再利用免疫组化检测锁定的关键分子CYP2J3、CHOP、MTCO-1、SDHB的表达,利用酶联免疫吸附试验检测线粒体呼吸链酶复合物的活性和产生ATP的水平,最后利用HE染色和天狼星红染色分析心肌组织的病理学变化。综合判断OPD干预低氧心肌损伤GDC-0068配制和抗疲劳的效果,比较野生型和CYP2J KO鼠的药理效应差异。3.基于代谢组学技术的OPD的作用机制研究进一步通过非靶向代谢组学技术,通过比较野生型和CYP2J KO大鼠及不同给药剂量间动物代谢物的差异,深入挖掘低压低氧条件下CYP2J基因作用和OPD干预的可能机制以及关键代谢物和代谢通路。结果:1.抗疲劳实验表明,OPD干预可以明显提高常氧条件下负重游泳小鼠的负重游泳时间,改善其血生化指标(CK和TRIGL),增加非负重游泳小鼠的肝糖原储备,减少非负重游泳小鼠的血乳酸堆积,表明OPD可以提高小鼠的抗疲劳能力。2.模拟低氧导致的心肌损伤实验表明,OPD干预可显著提高缺氧野生型大鼠的跑步位移,提高红细胞数量,降低大鼠血清中心肌损伤标志物和关键心肌酶谱的水平,降低心肌组织氧化应激水平,提高线粒体呼吸链酶复合物的活性,并能抑制内质网应激相关分子,凋亡蛋白和HIF-1a的表达,增加线粒体相关分子的表达,提高ATP含量,病理学结果显示OPD干预可明显逆转野生型大鼠的心肌损伤。而OPD对CYP2J KO大鼠的保护作用明显减弱,体现在OPD对大鼠的心肌酶谱、线粒体呼吸链酶复合物的活性、线粒体相关分子的表达的影响,以及病理结果显示OPD对CYP2J KO大鼠有一定保护MCC950供应商作用,提示OPD发挥心肌保护作用,CYP2J靶点发挥关键作用。3.代谢组结果显示,CYP2J KO大鼠在氨基酸代谢、不饱和脂肪酸的合成等通路与野生型大鼠均有显著性差异,提示CYP2J KO大鼠心肌损伤相比野生型大鼠更严重。OPD干预后对缺氧野生型大鼠的差异代谢物明显多于缺氧CYP2J KO大鼠,且代谢物回调效果明显优于CYP2J KO大鼠,提示OPD对CYP2J KO大鼠的预防保护心肌作用减弱,CYP2J靶点在OPD发挥心肌保护作用的过程中发挥重要作用。结论:OPD干预可以明显改善野生型大鼠急进高原导致的心肌损伤,OPD对CYP2J KO大鼠的心肌损伤保护作用相较于野生型大鼠减弱。因此通过野生型和CY2J KO型比较可知其始动环节可能CYP2J靶点密切相关,其分子事件与抑制心肌氧化应激和内质网应激,调节线粒体呼吸链复合物的活性和维持相关蛋白表达水平有关。代谢组学结果显示,OPD干预对缺氧野生型大鼠的心肌损伤保护作用相关的代谢通路主要集中在氨基酸代谢、脂代谢、嘌呤代谢、磷酸戊糖途径等,但对缺氧CYP2J KO大鼠影响较小,均提示CYP2J靶点在OPD发挥心肌保护作用中发挥关键作用。