溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种慢性肠道炎症性疾病,其特点为反复发作或迁延不愈的肠道黏膜炎症,病变部位位于结直肠,发病率在世界范围呈逐年上升趋势。UC临床表现主要是血便与腹泻,严重影响患者的生活质量。UC的发病机制尚不明确,其疾病进展主要包括肠屏障功能受损、肠黏膜炎症反应及肠道菌群紊乱等方面。UC临床治愈困难,尽管近十年来生物药物广泛应用增加了UC的临床治疗缓解率,但远期治愈率并未明显增加,并且生物药物价格昂贵,给社会公共医疗带来了沉重的经济负担,因此研究符合我国国情且能有效治疗UC的药物对UC患者及国家医疗均有重要意义。天然植物产物在自然界中含量丰富且能产生众多不同结构的次级代谢产物,其中包括大量具有抗炎活性的小分子化合物,是研发UC药物的主要来源之一。紫檀茋(pterostilbene,PTE)属于多酚类化合物广泛存在于葡萄树和蓝莓中,生物利用度及代谢稳定性高,PTE在多种慢性炎症模型中有良好的抗炎和抗氧化生物活性,然而目前对于PTE治疗UC的机制了解较为表浅,需要结合UC疾病进展的机制系统性地阐明PTE缓解UC的分子机制。本研究通过动物实验结合细胞实验阐明PTE治疗UC的分子机制,为PTE治疗UC临床前研究和临床转化提供研究基础。本文的主要研究结果如下:第一部分:构建UC小鼠模型及研究PTE疗效。应用葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导构建UC小鼠模型,并通过小鼠体重变化、疾病活动指数(disease activity index,DAI)、结肠组织病理评分、结肠炎症因子水平等确定模型构建成功。通过PTE干预后能够明显缓解UC小鼠症状,降低DAI评分及结肠组织病理评分,ELISA分析显示PTE可显著降低UC小鼠结肠组织中肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factorα,TNF-α)、白介素(Interleukin,IL)-6(IL-6)、IL-1β及活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,降低血浆C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)水平。此外RAD001体外PTE还可提高结肠组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-px)水平。Western blotting分析显示PTE还可增加UC小鼠结肠组织中紧密连接蛋白(tight junction proteins,TJs)(ZO-1,Occludin)、附着连接蛋白(adherens junction proteins,AJs)(E-cadherin,β-catenin)的表达,降低UC小鼠血浆FITC-葡聚糖(FITC-dextran)水平。最后,Western blotting分析显示PTE可激活小鼠结肠组织中核因子E2相关因子2(nuclear factor NF-E2-related factor2,Nrf2)通路并增加下游血红素加氧酶1(Heme Oxygenase-1,HO-1)及醌NAselleck产品DH脱氢酶1(NAD(P)H dehydrogenase[quinone]1,NQO1)表达,同时可抑制核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)通路。以上结果表明PTE可明显缓解UC小鼠症状,降低结肠炎症反应及氧化应激,同时维持肠道屏障功能,该作用可能是通过Nrmolecular oncologyf2实现。第二部分:研究PTE抑制UC小鼠结肠炎症的分子机制。选取鼠源巨噬细胞(macrophage,MΦ)RAW264.7细胞及人源单核细胞THP1细胞作为研究对象,使用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导构建MΦ炎症模型以进一步研究PTE抑制MΦ炎症反应机制。首先通过CCK-8毒性检测及ELISA分析抑制炎症因子程度确定PTE最适工作浓度。Western blotting分析显示PTE可显著增加RAW264.7细胞及THP1细胞细胞核中Nrf2水平,同时增加下游HO-1、NQO1表达水平。PTE可抑制LPS诱导RAW264.7细胞及THP1细胞中ROS水平、增加细胞中SOD及GSH-px水平,使用si RNA干扰细胞中Nrf2表达后PTE失去以上作用。ELISA分析显示PTE可抑制LPS诱导RAW264.7细胞及THP1细胞中TNFα、IL-6及IL-1β表达水平,使用si RNA干扰细胞中Nrf2表达后PTE失去以上作用。Western blotting分析显示PTE可抑制LPS诱导RAW264.7细胞及THP1细胞中p65及JNK磷酸化水平,细胞免疫荧光(Immunofluorescence,IF)结果显示PTE可抑制LPS诱导RAW264.7细胞及THP1细胞中p65核转位,使用si RNA干扰细胞中Nrf2表达后PTE失去以上作用。以上结果表明,PTE通过Nrf2抑制MΦ氧化应激以及炎症反应。第三部分:研究PTE维持肠黏膜屏障功能的分子机制。选取人Caco-2细胞作为研究对象,使用TNF-α诱导构建Caco-2细胞单层屏障损伤模型。Western blotting分析显示PTE可显著增加Caco-2细胞细胞核中Nrf2水平,同时增加下游HO-1、NQO1表达水平。PTE能够明显缓解TNF-α诱导降低Caco-2细胞单层的跨膜电阻值(transepithelial electrical resistance,TEER),同时降低对FITC-葡聚糖的通透性,而在加入Nrf2特异性抑制剂ML385后,PTE失去上述作用。PTE可抑制TNF-α诱导Caco-2细胞单层中ROS水平、增加SOD及GSH-px水平,加入ML385后PTE失去以上作用。Western blotting分析显示PTE可抑制TNF-α诱导Caco-2细胞单层中p65磷酸化水平,IF结果显示PTE可抑制p65核转位,加入ML385后PTE失去以上作用。Western blotting分析显示各组Caco-2细胞单层中TJs和AJs表达无明显差异,PTE可显著降低TNF-α诱导Caco-2细胞单层中肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)及肌球蛋白(Myosin)与埃兹蛋白(Ezrin)的磷酸化水平,IF显示PTE可降低p-Ezrin、p-MLC在ZO-1附近的共区域化聚集,缓解细胞皱缩状态,加入ML385后PTE失去以上作用。以上结果表明,PTE通过Nrf2减少炎症状态下肠上皮细胞cestinal epithelial cells,IECs)的氧化应激,进而降低IECs损伤,同时通过Nrf2维持TJs与AJs正常结构,最终达到维持肠上皮屏障功能的作用。第四部分:研究PTE对肠道菌群的重塑作用。收集各组小鼠粪便,提取粪便中DNA,对肠道菌群16S r RNA基因V3-V4区PCR扩增,使用Illumina Mi Seq平台测序。使用R语言对于测序结果进行生物信息学分析,结果显示,PTE能够显著提高UC小鼠肠道菌群的Chao1指数、Shannon指数及Simpson指数;主坐标分析(principal coordinateanalysis,PCo A)显示PTE干预后UC小鼠肠道菌群矩阵更接近于对照组(Control)。物种组成成分分析及线性判别分析(Linear discriminant analysis Effect Size,LEf Se)显示,PTE可增加UC小鼠肠道菌群中有益生菌丰度如Lachnospiraceae及Oscillospira等,减少有害菌丰度如Allobaculum、Bacteroides及Paraprevotella等维持肠道稳态。Spearman相关性分析显示Roseburia、Prevotella及Rikenella与ZO-1、Occludin的表达显著正相关,而与结肠通透性明显负相关;Allobaculum、Bacteroides及Paraprevotella与结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β及ROS水平显著正相关,而与结肠中SOD活性及GSH-px活性显著负相关。以上结果表明,PTE干预后可有助于提高UC小鼠肠道菌群多样性,通过增加有益菌丰度减少有害菌丰度维持肠道稳态。综上,本研究首次结合UC疾病进展的机制系统性地阐明PTE明显缓解UC小鼠症状的分子机制:(1)PTE通过Nrf2抑制MΦ氧化应激以及炎症反应。(2)PTE可增加TJs和AJs表达水平,以维持肠上皮屏障完整性;通过Nrf2减少炎症状态下IECs的氧化应激,降低肠上皮屏障损伤;通过Nrf2维持TJs与AJs正常结构,以促进因炎症受损肠上皮屏障的修复,最终达到恢复肠黏膜屏障功能的作用。(3)PTE干预后可有助于提高UC小鼠肠道菌群多样性,通过增加有益菌丰度减少有害菌丰度维持肠道稳态。本研究结果揭示了PTE作为治疗UC药物的潜力,为将来PTE治疗UC的临床应用提供了科学依据。