云南道地药材红大戟Knoxia valerianoides Thorel ex Pitard为茜草科植物红大戟的干燥块根,具有泻水逐饮,消肿散结的功效,临床上用于治疗水肿、痈肿疮毒及胸腹积水等。红大戟属泻下药的峻下逐水Erastin使用方法药,生品具有毒性,通过醋法炮制后可缓解峻泻作用,降低胃肠道刺激。但目前醋法炮制红大戟的减毒存效机理尚不清晰。因此,本文拟以“成分转变-毒效变化”为切入点,通过体外细胞毒性模型和体内癌性腹水模型,评价红大戟醋制前后毒性及药效变化,基于代谢组学分析红大戟醋制前后化学成分的变化规律,探讨红大戟醋制前后化学成分转变与毒效变化的相关性,以阐明红大戟醋制减毒存效的炮制机理,为传统中药红大戟炮制研究提供理论依据。主要研究内容和结果如下:1、基于代谢组学分析红大戟醋制前后化学成分变化利用UHPLC-Q-TOF-MS技术对红大戟醋制前后的化学成分进行检测,共鉴定出1077种代谢物。通过PCA和OPLS-DA分析,发现生红大戟和醋制红大戟分类良好。在正、负离子模式下,筛选并鉴定了68种差异代谢物,包括蒽醌类21个、黄酮类12个、脂类16个等。红大戟醋制后蒽醌类化合物含量显著下降,表明醋制后红大戟毒性降低可能由蒽醌类化合物被破坏所引起。2、红大戟醋制前后毒性部位筛选及肠道毒性变化研究采用CCK-8法检测生红大戟和醋制红大戟不同极性部位提取物对IEC-6细胞存活率的影响,筛选获得生红大戟的主要毒性部位为乙酸乙酯部位,其IC_(50)值为55.12μg/m L。利用UPLC-Q-TOF-MS分析发现红大戟乙酸乙酯部位中蒽醌类化合物为其主要毒性成分,其中大黄素和大黄酸显著抑制IEC-6细胞存活率,促进细胞凋亡。与生红大戟相比,醋制红大戟乙酸乙酯层提取物能显著提高IEC-6细胞存活率,其IC_(50)值为97.88μg/m L,初步表明红大戟醋制后具有减毒效果。一方面,醋制红大戟能够显著降低细胞内丙二醛(MDA)含量和乳酸脱氢酶(LDH)活性,增加超氧化物歧化酶(SOD)的活力,以降低氧化应激反应,缓解毒性。另一方面,醋红大戟通过减少DNA损伤,提高IEC-6细胞的细线粒体膜电位,进而减少IEC-6细胞凋亡。进一步研究表明,醋制红大戟促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,抑制促凋亡蛋白Bax、Caspase 3和Caspase 9的表达,来抑制IEC-6细胞的凋亡,从而降低细胞毒性。红大戟醋制前后乙酸乙酯层提取物对大鼠的急性毒性研究表明,醋制红大戟乙酸乙酯提取物能显著降低大鼠血浆中AST和ALT活性;降低肝脏组织中MDA含量,增加肝脏组织中SOD活力,缓解肝损伤。从大鼠肝脏组织病理切片可以看出,生红大戟组肝索排列紊乱,炎性细胞浸润,而醋制红大戟肝脏结构基本正常,稍有炎性反应。3、红大戟VP-16临床试验醋制前后药效部位筛选及祛腹水药效变化研究采用癌性腹水小鼠模型,评价生红大戟和醋制红大戟不同极性部位的祛腹水作用,结果表明生、醋红大戟正丁醇层提取物均能减少小鼠腹水量、增加尿量和粪便含水量;降低小鼠肾脏中醛固酮(ALD)和抗利尿激素(ADH)水平,减少肾脏对水和钠的重吸收,缓解腹水;上调肾脏组织中水通道蛋白AQP1、AQP2、AQP4及AQP8的蛋白表达。小鼠肾组织的免疫荧光显示,生、醋红大戟正丁醇层提取物组小鼠肾组织中AQP1、AQP2及AQP4荧光表达明显增加,其中醋制红大戟效果优于生红大戟。此外,采用UPLC-QTOF-MS分析发现红大戟醋制前后正丁醇部位中化学成分变化不显著,主要为皂苷、黄酮类。以上结果表明,生、醋红大戟正丁醇部位通过调节腹水小鼠肾脏组织中水通道蛋白,起到利尿祛腹水作用。结论:1、红大戟的主要毒性成分为蒽醌medical record类化合物,醋制可以使红大戟中的蒽醌类成分被破坏,进而使毒性降低。2、红大戟的毒性部位为乙酸乙酯部位,醋制红大戟能降低红大戟的肠细胞毒性与肝毒性,其机制可能与提高细胞抗氧化酶的活性,降低氧化应激,抑制细胞凋亡,调节Bax/Bcl-2、Caspase 3、Caspase 9蛋白表达相关,从而起到醋制减毒效果。3、红大戟的药效部位为正丁醇部位,醋制红大戟能降低ALD和ADH水平,缓解腹水;通过调节腹水小鼠肾脏组织中水通道蛋白AQP1、AQP2、AQP4和AQP8起到利尿祛腹水功效。