苏氨酸醛缩酶(Threonine aldolases,TAs)可以甘氨酸为供体,以脂肪族醛或芳香族醛为受体,发生醇醛缩合反应及其逆反应催化合成b-羟基-a-氨基酸。b-羟基-a-氨基酸是许多农用化学品和药物的重要前体物质,在医药和精细化工领域有着举足轻重的地位。TA可以在温和的反应条件下,催化一步反应直接合成b-羟基-a-氨基酸,但其在C_b的非对映选择性很低,“C_b”问题一直备注研究者的关注,严重阻碍了TA在工业生产中的应用。本研究基于氨基酸序列与结构信息对来源于Pseudomonas putida的L-TA进行蛋白质工程改造。研究其裂解天然底物L-苏氨酸和L-别-苏氨酸的酶活及酶学性质,通过对关键氨基酸位点的饱和突变提高了酶裂解L-苏氨酸和L-别-苏氨酸的酶活。同时基于其醇醛缩合反应方向酶活建立了DNPH比色的高通量筛选方法,结合饱和突变与迭代组合突变提高了其合成4-甲磺酰基苯基丝氨酸的催化效率。此外通过计算机辅助设计结合三密码子饱和突变等策略,进一步提高了L-TA催化合成4-甲磺酰基苯基丝氨酸的催化效率,并扩展了其催化底物范围。主要研究内容如下。(1)L-TAs的挖掘、表达纯化及酶学性质的测定。基于L-TA特有的结构域和功能域,钓取了Pseudomonas putida KT2440、Pseudomonas protSmoothened Agonistegens CHA0和Pseudomonas putida PSALD中编码L-TA的基因,转化至Escherichia coli BL21(DE3)进行异源表达。酶活测定结果显示KT2440、CHA0和PSneedle biopsy sampleALD裂解L-苏氨酸的酶活分别为5577、5407和8465 U·mg~(-1),裂解L-别-苏氨酸的酶活分别为14311、8918和16814 U·mg~(-1)。KT2440、CHA0和PSALD均在p H 8.0时酶活力达到最高,且在p H 7.0-9.0范围内酶活力比较稳定。KT2440、CHA0和PSALD的最适反应温度分别是50°C、55°C和55°C,且临界温度分别为45°C、40°C和50°C。此外,K更多T2440和CHA0均在TBME中有相对较好的有机溶剂耐受性,但PSALD的有机溶剂耐受性较差。Mg~(2+)和Ca~(2+)对KT2440、CHA0和PSALD的酶活均有明显的促进作用。(2)KT2440传统酶活测定与产物合成效率匹配性研究。通过分子对接与结构分析,选择P.putida KT2440的L-TA底物结合口袋内的5个氨基酸位点进行饱和突变。Ser10、His89、Arg177和Arg321的饱和突变菌株基本完全丧失裂解L-苏氨酸的酶活性,Asp93位点中有八个突变体显示出比野生型高3-8倍的酶活性,其中突变酶Asp93His表现出最优的酶活性,裂解L-苏氨酸及L-别-苏氨酸的酶活分别为52214和68898 U·mg~(-1),相比野生型分别提高了9.4倍和4.8倍。此外该酶对L-苏氨酸及L-别-苏氨酸的k_(cat)/K_m值分别为2925和4515 s~(-1)·m M~(-1),分别是野生型酶的3.6倍和6.6倍。而且该酶的变性温度为54.2°C,相比野生型酶提高了5°C。究其原因,发现Asp93His拉近了其侧链与底物羟基和氨基之间的距离,并与His133形成了p-p键,因此,突变体Asp93His表现出提高的催化效率和热稳定性。L-TA催化合成4-甲磺酰基苯基丝氨酸的效率和传统测定L-TA裂解L-苏氨酸的酶活存在不完全对应关系,表明二者的匹配性不高,因此有必要筛选一种有效的酶活测定方法。(3)基于合成酶活方向定向进化提高KT2440产物合成效率。基于醇醛缩合反应方向建立2,4-二硝基苯肼(DNPH)的高通量筛选方法,筛选出5个位于催化口袋附近的氨基酸位点,对其进行饱和突变后鉴定出13个合成酶活提高的突变菌株。以野生型酶KT2440与突变酶为催化剂合成4-甲磺酰基苯基丝氨酸,结果显示Ala9Val、Tyr13Lys和Tyr312Arg具有最优的催化活性,对其进行迭代组合突变后突变酶A9V/Y13K/Y312R的转化率和de值分别为72.6%和86.1%,与野生型酶相比,其转化率和de值分别提高了2.2倍和4.9倍。分子催化机制解析表明突变体A9V/Y13K/Y312R重塑了结合口袋且增强了产物与催化口袋附近氨基酸位点的相互作用力,因此该酶提高了其催化效率。(4)产物通道与辅因子结合域改造提高KT2440产物合成效率。通过分子对接与结构分析,挑选出产物通道结合区与辅因子结合区中32个关键氨基酸位点,对其进行亲和力分析后确定其中9个与催化功能相关的潜在位点进行突变。基于氨基酸序列比对与氨基酸残基保守程度,选择V-Q-Y作为构建单元进行三密码子饱和突变。获得3个功能靶点Asn12、Tyr35和Ala176,对其进行饱和突变后获得13株酶活提高的突变菌株,其中Asn12Gln、Tyr35Trp和Ala176Val的酶活力分别提高到13.33、12.81和10.64 U·mg~(-1)。此外在迭代组合突变中N12Q/Y35W/A176V的酶活提高到16.32 U·mg~(-1),k_(cat)/K_m值是野生型的2.8倍,生物合成4-甲磺酰基苯基丝氨酸的转化率和de值分别为78.3%和95.1%,并对它一系列的苯甲醛衍生物均表现出提高的转化率和de值。突变酶A9V/N12Q/Y13K/Y35W/A176V/Y312R生物合成4-甲磺酰基苯基丝氨酸的转化率和de值分别为82.6%和96.3%,分别是野生型的2.6和5.6倍。