1,4-丁二醇(1,4-BDO)作为一种大宗性的商品化学品,主要用作溶剂以及增湿剂,其衍生物可应用于化工合成、医药和化妆品等领域。而目前还未在生物体发现天然合成1,4-丁二醇的途径。本论文基于多酶级联催化方法,构建了一条以γ-丁内酯(GBL)为底物生产1,4-丁二醇的路径。γ-丁内酯作为底物虽然不具有直接的经济性,但是该路径的实施主要是为后续以葡萄糖为底物构建1,4-丁二醇及其高附加值衍生物合成路径提供基础支撑。该路径首先利用己内酯水解酶(Chn C)将γ-丁内酯水解开环生成4-羟基丁酸(GHB),接着在羧酸还原酶(Car)、醇脱氢酶(Yqh D)的作用下,将4-羟基丁酸两步还原成生成1,4-丁二醇;同时引入甲酸脱氢酶(FDH)构建了NADH/NAD~+辅酶循环再生系统。最终在上述4种酶的共同催化作用下实现了利用酶法高效生产1,4-丁二醇。主要研究结果如下:(1)将来源于红球菌(Rhodococcus sp.TK6)的Rschnc、来源于海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum)的Mmcar以及来源于大肠杆菌(Escherichia coli K12 MG1655)的Ecyqhd三种关键酶基因分别在E.coli BL21中成功克隆表达。酶学性质分析表明:Chn C的比酶活为0.95 U·mg~(-1),最适反应温度范围在35-40℃,在p H 7.0-9.0范围内具有较高的催化活性;Car的比酶活为0.28 U·mg~(-1),最适反应温度在30℃附近,在p H 7.0-8.0附近具有较高的催化活性;Yqh D的比酶活为0.43 U·mg~(-1),最适反应温度范围30-37℃,在p H 7.0附近具有较高的催化活性。(2)利用半理性设计的方法对Chn C酶蛋白进行稳定性改造,通过引入二硫键得到一株半衰期显著延长的突变体SPanobinostat小鼠1,有益突变点为selleckchem Ferrostatin-1K166C和A197C。该突变体在30-37℃条件下,半衰期由20 h左右变成35 h左右,提升1.75倍;在p H 7和8处相较于野生型半衰期也提升了20 h左右。其次针对转化过程中关键限速酶Car进行了设计改造,分别使用RBS序列优化和分子对接手段,最终得到突变体N1,其催化能力显著提高,在相同条件下的转化效率是野生型Car的2倍左右,有益突变点为A882H。(3)优化了多酶级联反应的生产工艺。在30℃、p H 7.0、关键酶酶活力(U·m L~(-1))添加量比例为1:3:2(Chn C:Car:Yqh D),γ-丁内酯添加量为5 g·L~(-1),反应时间60 h,1,4-丁二醇产量达到2.41 g·L~(-1),摩尔转化率为46.1%,产量与最初优化前相比提高至375.4%。在使用突变体S1以及N1后,反应60 h,1,4-丁二醇产量达到3.22 g·L~(-1),摩尔转化率为60.1%,产量相较于野生型提升至133.6%。(4)为了增加1,4-丁二醇的产量,采用底物流加策略。在不进行底物补加的情况下,使用突变体S1以及N1时,最终获medical malpractice得4.36 g·L~(-1)的1,4-丁二醇,产量为野生型的123.9%,摩尔转化率达到80.6%;在有底物流加时,1,4-丁二醇产量最高达到9.16 g·L~(-1),提升至野生型的145.2%,但是摩尔转化率仅为56.5%。在此基础上,继续延长反应的时间,最终1,4-丁二醇的积累量达到了12.97 g·L~(-1),产量相较于延长反应之前提升41.6%,摩尔转化率也提升至61.9%。