我国存在大量盐碱地,选育耐盐品种是开发利用盐碱地的有效途径。甘蓝型油菜(Brassica napus L.)作为世界上重要的油料作物之一,在我国的种植面积呈现下降的趋势。因此,选育耐盐碱油菜新品种,充分利用这些盐碱地来增加油菜的种植面积,缓解我国油料短缺显得尤为重要。而挖掘油菜耐盐基因,解析其分子调控机制,是指导耐盐碱油菜新品种选育的关键。B-box(BBX)蛋白作为一类锌指结构转录因子,在植物的生长发育过程中发挥重要作用。近年来,关于BBX蛋白在非生物胁迫响应中的功能研究越来越多。然而,甘蓝型油菜中BBX蛋白在盐胁迫中的功能研究还未见报道。因此,本研究对甘蓝型油菜BBX基因家族成员进行鉴定,依据公共转录组数据及实时荧光定量PCR(RT-qPCR),鉴定出耐盐关键候选基因BnBBX22.A07。筛选BnBBX22.A07互作蛋白及下游调控基因,结合过表达株系表型分析、转录组分析、生理生化指标及相关基因的表达分析,探究BnBBX22.A07影响植物耐盐性的分子调控机制。主要研究结果如下:1.关键耐盐候选基因BnBBX22.A07的鉴定:在甘蓝型油菜中鉴定到68个BnBBX基因家族成员,进化树和保守结构域分析表明该家族分为5个亚族。家族基因存在多个串联复制和片段重复事件,启动子区普遍存在多个胁迫响应元件。公共转录组数据表明拟南芥中仅第四亚组成员AtBBX18、AtBBX22和AtBBX23受盐胁迫诱导表达,因此我们利用RT-qPCR分析这三个基因在甘蓝型油菜中的同源基因在盐胁迫下的表达情况,发现只有BnBBX22受盐胁迫诱导上调表达。与BnBBX22其它同源拷贝相比,只有BnBBX22.A07受盐胁迫诱导持续上调表达,并且BnBBX22.A07也受PEG6000诱导上调表达,以此将其作为关键耐盐候选基因。2.BnBBX22.A07在各个组织中均有表达,且相对于其它组织在根中的表达量最高。BnBBX22.A07编码290个氨基酸,存在两个典型的B-box锌指蛋白结构域,亚细胞定位和酵母转录激活活性表明BnBBX22.A07是定位于细胞核的转录激活子。3.过表达BnBBX22.A07增强拟南芥和油菜的耐盐和抗旱性:在正常和盐INCB018424 NMR处理下,过表达BnBBX22.A07的拟南芥株系的根长显著高于野生型。同样,过表达BnBBX22.A07的油菜株系的根长和鲜重显著高于对照株系。盐处理下,与野生型相比,过表达株系叶绿素和可溶性蛋白质含量显著增加,丙二醛(MDA)含量显著降低,过氧化物酶(POD)活性显著升高。干旱处理下,与野生型相比,过表达拟南芥株系的MDA含量显著降低,可溶性蛋白含量和POD活性显著升高。在甘蓝型油菜中,干旱复水之后,过表达株系表型基本恢复正常,表现出高达81.11%的相对含水量(RWC),然而对照株系RWC只有25.38%。此外,正常条件下,与对照株系相比,过表达油菜株系在芽期表现出较短的下胚轴,在苗期表现多叶,在成熟期从底部分出多个主茎,表现多分枝。4.BnBBX22.A07通过减少盐胁迫下活性氧(ROS)的产生增强油菜的耐盐性。通过RNA-seq对过表达油菜株系和对照株系在正常和盐胁迫条件下的叶片进行转录水平动态分析,对盐胁迫下转基因株系与对照株系间的差异表达基因(DEGs)进行GO和KEGG富集分析,结果表明上调DEGs主要富集到亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、苯丙烷生物合成等代谢途径及MAPK信号通spatial genetic structure路,而下调DEGs则主要富集到光合生物的碳固定、乙醛酸和二羧酸代谢、氮代谢、光合作用、类胡萝卜素生物合成、糖胺聚糖降解和核糖体等能量代谢途径。此外,在盐处理下,过表达株系中ROS清除相关基因,包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽转移酶和黄酮类生物合成相关基因的表达量显著高于对照株系。DAB和NBT染色结果表明,与对照株系相比,低盐处理(100 m M NaCl)下过表达株系中过氧化氢(H_2O_2)含量较低,而高盐处理(200 m M NaCl)下过表达株系中超氧根离子(O~(2.-))含量较低。与ROS水平结果一致,低盐处理下,过表达株系中过氧化氢酶(CAT)和POD活性显著高于对照株系;高盐处理下,过表达株系中SOD活性显著高于对照株系。5.BnBBX22.A07与BnHY5.C09互作:酵母双杂交、双分子荧光互补以及荧光素酶互补技术验证BnBBX22.A07和BnHY5.C09蛋白存在物理互作。BnHY5.C09受盐胁迫诱导上调表达,过表达BnHY5.C09增强拟南芥的耐盐性。与野生型相比,盐处理下BnHY5.C09过表达拟南芥株系的根长和鲜重显著增加,可溶性蛋白质含量显著增加,MDA含量显著降低,CAT、SOD和POD活性显著升高,叶片中ROS含量显著降低。此外,盐处理下BnWRKY33.C03过表达拟南芥株系中超氧化物歧化酶(AtSOD1)、过氧化氢酶(AtCAT2)和过氧化物酶(AtPerx34)基因的表达量显著高于野生型。6.BnHY5.C09与BnWRKY33.C03互作:酵母单杂及双荧光素酶报告基因检测证明BnHY5.C09结合BnWRKY33.C03启动子上的G-box或C-box元件并激活其表达。BnWRKY33.C03受盐胁迫诱导表达,过表达BnWRKY33.C03增强拟南芥的耐盐性。与野生型相比,盐处理下BnWRKY33.C03过表达拟南芥株系的根长和鲜重显著增加,可溶性蛋白质含量显著增加,MDA含量显著降低,CIACS-010759分子式AT、SOD和POD活性显著升高,叶片中ROS含量显著降低。此外,盐处理下BnWRKY33.C03过表达拟南芥株系中AtSOD1、AtCAT2和AtPerx34基因的表达量显著高于野生型。7.AtWRKY33作为BnBBX22-BnHY5级联的下游发挥作用,介导植物的耐盐性。BnBBX22.A07过表达株系转录组分析表明BnBBX22.A07调控盐胁迫下BnWRKY33基因的表达。RT-qPCR结果表明,正常和盐胁迫条件下,BnHY5.C09过表达拟南芥株系中AtWRKY33的表达显著高于野生型。在BnBBX22.A07过表达拟南芥株系(BnBBX22-OE)中利用CRISPR/Cas9编辑系统突变AtWRKY33,获得cWRKY33BnBBX22-OE株系。耐盐性鉴定表明,盐处理下BnBBX22-OE株系耐盐性显著高于野生型,根长和鲜重显著高于野生型,而cWRKY33 BnBBX22-OE株系的耐盐性显著降低,根长和鲜重减少到与野生型一致的水平。wrky33拟南芥突变体的耐盐性和根长显著低于野生型。综上所述,本研究对甘蓝型油菜BBX基因家族进行了鉴定,揭示了甘蓝型油菜BnBBX22.A07基因通过BnBBX22-BnHY5-BnWRKY33级联通路,平衡盐胁迫下WRKY33介导的ROS水平,从而调控植物耐盐性的分子机制,为甘蓝型油菜耐盐育种提供了理论基础。