油菜是我国重要的油料作物,目前围绕油菜的多功能用途已经形成了一系列产业链,对我国的经济发展有着不可替代的作用。近年来,油菜根肿病已成为制约油菜生产的重要病害,且危害面积呈逐年增加的趋势。通过化学生物防治根肿病存在着成本高、防治效果不佳、污染环境等缺点,培育抗根肿病油菜新品种是防治根肿病最有效的措施。挖掘新的抗根肿病基因并解析其抗病机制是指导培育抗病新品种的关键。因此,本研究以人工合成的抗根肿病芥菜型油菜CT19Regorafenib核磁和感病芥菜型油菜陕北黄芥为亲本,构建F_2分离群体,利用简化基因组测序对根肿病抗性基因进行定位,结合转录组分析筛选候选基因,并在模式植物拟南芥以及甘蓝型油菜中验证其抗病功能,通过转录组分析探究候选基因调控根肿病抗性的分子机制,为根肿病抗性机理的研究提供理论基础。研究的主要结果如下:1.抗根肿病候选基因的挖掘:为了挖掘新的抗根肿病基因,以人工合成的强抗根肿病的芥菜型油菜CT1PF-073213329和感病陕北黄芥为亲本,构建F_2群体,并对170份F_2群体单株进行简化基因组测序分析,结合F_2群体对根肿病的抗感病表型,共鉴定到三个与根肿病抗性显著关联的QTLs(q CRa3-1、q CRa5-1和q CRb2-1),q CRa3-1位于A03染色体上25.09 Mb-25.54 Mb区段内,表型贡献率为74.30%,该区间内含有66个注释基因;q CRa5-1位于A05染色体上35.28Mb-35.84 Mb区段内,表型贡献率为2.5%,区间内含有87个注释基因;q CRb2-1位于B02染色体上55.69 Mb-56.04 Mb区段内,表型贡献率为6%,区间内含有56个注释基因。其中,B02和A05上的抗根肿病位点q CRa5-1和q CRb2-1是首次被报道。结合抗感亲本接菌后根系转录组数据,在主效抗根肿病位点q CRa3-1区间内筛选到了22个在接种根肿菌后7天或者14天后有表达差异的基因,最终确定了两个具有TNL(Toll interleukin-1 receptor-like nucleotide-binding site leucine-rich repeat)结构的候选基因Bju VA03G52300和Bju VA03G52310,可能为关键的抗根肿病基因。2.基因BjuVA03G52300的功能验证:通过分析BjuVA03G52300的序列,鉴定到Bju VA03G52300在白菜中对应着两个不同的基因,Bra019412和Bra019413。过表达Bra019412在抗感亲本中都具有的同源拷贝Bju VA03G52300-RS1在拟南芥中能够减轻根肿病的症状,而过表达抗病亲本中特有的同源拷贝Bju VA03G52300-R1在拟南芥中增强了对根肿病的易感性。过表达Bra019413在抗病亲本中特有的拷贝能够减轻根肿病的症状。为了探究Bju VA03G52300-R1对根肿病易感性的调控机理,对野生型、BjPCR Equipmentu VA03G52300-R1OE和Bju VA03G52300-RS1OE株系在接种根肿菌14天时进行了转录组测序,结果表明Bju VA03G52300-R1OE株系中,有多个天冬氨酸蛋白酶的表达被诱导。为了探究天冬氨酸蛋白酶是否对根肿病的抗性具有调控作用,通过CRISPR技术构建了编码天冬氨酸蛋白酶基因(AT4G22050和AT1G03220)的拟南芥双突变体asp2-4,asp2-4增强了对根肿病的易感性。对asp2-4在接种根肿菌14天进行转录组测序,我们发现asp2-4与Bju VA03G52300-R1OE在接种根肿菌前后的共同差异表达基因共2751个,因此,Bju VA03G52300-R1可能通过影响天冬氨酸蛋白酶基因的表达,从而调控对根肿菌的抗性3.基因BjuA014074的功能验证:通过对抗、感亲本在根肿菌接种后根系的转录组数据分析,一类PR蛋白在感病亲本中被诱导上调表达,其中有7个差异表达基因在拟南芥中的同源基因均为AtCAPE3,并且其基因编辑突变体cape3-c1对根肿菌更敏感,通过对异源过表达Bju A014074的拟南芥接种根肿菌分析,抗病亲本中的拷贝Bju A014074-R和感病亲本中的拷贝Bju A014074-S分别表现出对根肿病更抗和更感的表型。通过对过表达Bju A014074-R与Bju A014074-S的拟南芥株系接种根肿菌14天后根系进行转录组分析,发现在接种根肿菌后过表达Bju A014074-R的株系在接种根肿菌后PR蛋白家族基因表达量显著高于野生型和过表达Bju A014074-S株系,同时Bju A014074-R过表达株系中与木栓质合成、ROS爆发和激素相关基因表达量也显著高于野生型和过表达Bju A014074-S株系,因此Bju A014074-R可能通过与其他PR蛋白相互作用,激活木栓质合成、ROS爆发和调控激素通路从而提高对根肿病的抗性。同时将过表达Bju A014074-R的载体转化到本实验室易感型甘蓝型油菜骨干亲本530c中,目前共获得15棵T_0代阳性植株。4.木栓质和脂肪酸在根肿菌侵染中发挥重要作用:通过对前期Bju VA03G52300-RS1OE、Bju VA03G52300-R1OE、Bju A014074-ROE、BjuA014074-SOE、asp2-4和野生型Col-0接种根肿菌14天后根系转录组数据的综合分析,表明脂肪酸、木栓质和植物激素可能在根肿病入侵中发挥重要作用,因此,利用GUS染色对相关途径的关键基因的表达模式进行分析。结果表明,木栓质合成和脂肪酸通路相关基因受根肿菌胁迫诱导表达。通过观察木栓质通路中关键基因的突变体对接种根肿菌的抗性,我们发现木栓质可能在根肿菌侵染前期被抑制,侵染后期被诱导。通过对脂肪酸通路关键基因的根肿菌接种试验,表明脂肪酸在根肿菌侵染中发挥着负调控的作用,同时利用气相色谱对接种的突变体根部进行分析,发现亚油酸(18:2)可能是根肿菌从寄主植物中获取的关键脂肪酸。5.乙烯在根肿菌侵染过程发挥重要作用:通过对乙烯信号通路关键转录因子EIN3/EIL1的突变体接种根肿菌试验及外源乙烯处理试验,表明乙烯可能在根肿菌侵染前期发挥着正调控作用,在侵染后期发挥着负调控作用。通过定量分析和启动子分析,WRKY75可能是被EIN3直接调控,同时WRKY75可能通过对水杨酸、茉莉酸和活性氧的调控增强对根肿病的抗性。本实验中,利用对抗根肿病芥菜型油菜抗根肿病基因的定位、克隆和功能验证,挖掘了新的抗根肿病QTL位点,对抗根肿病的分子机制进行了初步解析,为抗根肿病基因的挖掘和育种提供了依据。