卵泡是哺乳动物卵巢的基本结构和功能单元。同一时期内卵巢中存在着许多不同发育阶段的卵泡,但只有极少数可发育至成熟卵泡并在促性腺激素作用下排出卵母细胞。卵泡发育和排卵是一个受内分泌、旁分泌和多种基因共同调控的生理过程,因此深入探究卵泡发育和排卵对进一步提高母猪的繁殖力具有重要的理论意义和实用价值。本课题组前期对太湖猪和大白猪排卵前的卵泡组织进行转录组测序,筛选得到差异表达的干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)。本研究在课题组前期的工作基础Herbal Medication上,通过CRISPR/Cas9技术构建Isg15基因敲除小鼠,探究其在卵泡发育和排卵过程中的功能。主要研究内容与结果如下:1.利用基因敲除小鼠模型研究Isg15基因在卵泡发育和排卵过程中的作用(1)Isg15基因的敲除可以提高雌性小鼠的生育能力。使用CRISPR/Cas9技术成功构建了Isg15基因敲除小鼠模型。Isg15~(-/-)雌性小鼠的累积产仔数、植入胚胎数、自然排卵数均高于Isg15~(+/+)雌性小鼠。尽管Isg15~(-/-)雌性小鼠表现出高生育力,但Isg15基因的敲除并不影响其发情周期及促性腺激素FSH、LH的分泌。(2)Isg15基因的敲除可以促进雌性小鼠的卵泡发育。对Isg15~(+/+)小鼠和Isg15~(-/-)小鼠的卵巢组织进行H&E染色:3周龄时,Isg15~(+/+)和Isg15~(-/-)小鼠卵巢的组织学形态相似,各级卵泡数目均无显著差异;而到8周龄时,Isg15~(-/-)小鼠卵巢中的黄Erastin试剂体数高于Isg15~(+/+)雌性小鼠。(3)Isg15基因的敲除可以提高雌性小鼠的排卵率。腹腔注射PMSG/h CG构建小鼠超数排卵模型,进一步探究Isg15基因对排卵过程的影响。通过H&E染色发现:PMSG处理后,Isg15~(+/+)和Isg15~(-/-)小鼠卵巢中有腔卵泡的数目并无差异;但注射h BIBW2992体内CG后,Isg15~(-/-)小鼠排卵前卵泡数、黄体数和排卵数显著高于Isg15~(+/+)小鼠。酶联免疫吸附试验结果显示PMSG/h CG处理后提高了Isg15~(-/-)小鼠血清中的雌激素和孕激素水平。(4)Isg15基因的缺失促进卵丘卵母复合体扩张并抑制颗粒细胞的凋亡。体外分离培养小鼠卵丘卵母复合体并观察其生长状况,发现Isg15基因的敲除促进了卵丘卵母复合体的扩张。同时,TUNEL、流式细胞术和Western blot发现,抑制Isg15基因可以降低卵巢颗粒细胞的凋亡,有利于排卵前卵泡的形成。2.Isg15基因在小鼠卵巢颗粒细胞中的机制研究(1)Isg15及ISGylation修饰系统相关基因(Uba7、Ube2l6、Herc6)影响卵泡发育和排卵相关基因的表达和雌激素合成。RT-PCR、Western blot和ELISA发现,Isg15及ISGylation修饰相关基因可以下调卵泡发育和排卵相关基因的表达水平,并且抑制卵巢颗粒细胞合成雌激素,去泛素化酶Usp18与上述结果相反。随后,通过定点突变试验成功构建了ISGylation修饰活性丧失的突变型Isg15aa表达载体,并证明了Isg15aa不影响卵巢颗粒细胞中的卵泡发育和排卵相关基因的表达以及雌激素合成。(2)免疫沉淀-质谱测序分析并筛选ISG15候选底物蛋白。通过质谱测序分析发现,Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶1(a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motif,ADAMTS1)是ISG15的潜在底物蛋白。蛋白质免疫沉淀试验证明了E3连接酶HERC6介导ISG15与ADAMTS1之间的共价结合,去泛素化酶USP18则削弱ISG15与ADAMTS1之间的结合能力。(3)Lys309、Lys593、Lys597和Lys602是ADAMTS1上ISGylation的修饰位点。利用蛋白质结构域缺失法、氨基酸定点突变技术分别构建Adamts1缺失载体和Adamts1赖氨酸突变载体,并利用蛋白质免疫沉淀试验证明ADAMTS1上的ISGylation的修饰位点是Lys309、Lys593、Lys597和Lys602。(4)ISG15介导ADAMTS1的降解依赖于20S蛋白酶体途径。通过Western blot发现超表达Isg15促进ADAMTS1的ISGylation水平,但抑制ADAMTS1总蛋白表达水平。外源添加蛋白酶体抑制剂MG132缓解了ADAMTS1蛋白的降解。此外,20S蛋白酶体降低ADAMTS1的ISGylation修饰水平。综上所述,Isg15基因可参与调节雌性小鼠的卵泡发育和排卵过程。Isg15基因敲除小鼠具有较高的排卵率和生育力;ISG15通过ISGylation修饰系统(UBA7、UBE2L6、HERC6)与ADAMTS1共价结合并通过20S蛋白酶体降解ADAMTS1蛋白,进而抑制卵巢颗粒细胞中排卵相关基因的表达及激素合成。总之,本研究揭示了ISG15在卵泡发育和排卵事件中的新作用,并确定了ISG15介导的ISGylation修饰是调节哺乳动物排卵和生育力的一种新机制。