随着全球范围内系统性真菌感染的发病率和死亡率不断增加,真菌治疗面临严峻的挑战。因此开发有效的抗真菌疫苗有着十分迫切的现实意义。大多数抗真菌疫苗主要以真菌表面多糖抗原为靶点。这些多糖,如β-1,3-glucan糖抗原,在真菌各个生长阶段都具有高度的保守性,化学结构特异,是理想的疫苗设计靶点。传统疫苗构建策略是将糖抗原与载体蛋白偶联,然而载体蛋白具有较强的免疫反应,对糖抗原具有抑制作用。前期研究中发现免疫原性较弱的载体蛋白通过修饰鼠李糖(rhamnose,Rha)等半抗原小分子,能够招募内源性抗体并靶向抗原呈递细胞(antigen presenting cells,APCs),从而有效增强糖抗原的免疫反应。本文在此基础上,设计了一种氧化还原响应型连接臂将鼠李糖Rha修饰在载体蛋白BSA上,用于构建新型β-1,3-glucan真菌疫苗。体外实验和体内小鼠免疫活性评估发现,该氧化还原响应型连接臂能够促进溶酶体逃逸和抗原释放,有效增强β-1,3-glucan糖抗原的免疫反应。主要结论如下:(1)构建了氧化还原响应型β-1,3-glucan糖缀合物真菌疫苗。通过化学合成制备了刚性连接臂L1、氧化还原响应型连接臂L2以及Rha半抗原衍生物等化合物,经核磁及质谱验证其结构均正确。糖抗原β-1,3-glucan通过热凝胶酸水解的方法获得,并通过MAIDI-TOF-MS验证其聚合度为5-13。通过刚性连接臂L1将糖抗原与载体蛋白进行偶联得更多到β-glucan-BSA,糖抗原负载量为7.8%。再通过两种不同连接臂将Rha与β-glucan-BSA偶联得到β-glucan-BSA-L1-Rha、β-glucan-BSA-L2-Rha两种糖缀合物,Rha的负载量分别为2.2%、2.4%。(2)验证了氧化还原响应型连接臂能够响应还原条件断裂,促进疫苗分子的溶酶体逃逸。通过氧化还原响应型连接臂的体外动力学实验,验证了氧化还原型连接臂在存在还原剂的情况下,二硫键能够很快的发生断裂。通过溶酶体共定位实验分析,证明氧化还原响应型β-glucan-BSA-L2-Rha疫苗分子能够发生溶酶体逃逸,而刚性连接臂L1修饰的β-glucan-BSA-L1-Rha不能发生溶酶体逃逸。(3)氧化还原响应连接臂进一步提高了鼠李糖修饰载体蛋白构建β-glucan疫苗的免疫活性。通过小鼠体内免疫实验发现,与前期研究相同,在内源性抗体Rha的辅助下,Rha修饰的糖缀合物真菌疫苗的抗体滴度得到显著提升。并且氧化还原Compound 3临床试验响应biospray dressing型的糖缀合物真菌疫苗β-glucan-BSA-L2-Rha所引起的免疫反应最强,证明氧化还原型连接臂促进了疫苗分子的溶酶体逃逸,并有效提高了疫苗的免疫效率。同时,通过免疫荧光实验,证明疫苗产生的β-glucan抗体能够有效识别热灭活白色念珠菌(heat inactivated Candida albicans,HKCA)菌丝,说明疫苗激起的免疫反应具有真菌特异性识别能力。