目的:糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常见、致盲风险最高的微血管并发症,也是24-64岁人群视力障碍和失明的主要因素。随着全球糖尿病患者人数的增加,DR已经成为严重威胁人类视觉健康的原因之一。DR是一种前期没有明显视力下降的糖尿病并发症,随着时间的推移,慢性高血糖会引起血-视网膜屏障(blood-retina barrier,BRB)的破损,加重更多神经视网膜损伤,导致视力浑浊或模糊,同时视网膜内新生血管增多,血管渗透性增强导致出血以及黄斑水肿,最终导致失明。因此,研究糖尿病视网膜病变发生发展的分子机制,尤其是血-视网膜屏障破损和血管新生的诱发机制,对于发现有效的诊断和治疗新方法至关重要。BAG5是Bcl-2相关永生基因(Bcl-2-associated athanogene,BAG)抗凋亡基因家族成员,是唯一含有多个BAG结构域且不含其他结构域的家族成员,由5个BAG结构域构成了整个蛋白。BAG5与热休克蛋白HSP70/HCP70之间的相互作用具有双重效果。在正常生理状态下BAG5能够加速HSP70/HSC70介导的蛋白质重折叠。然而在病理状态下BAG5过表达可能会抑制HSP70伴侣蛋白作用,干扰蛋白质重折叠过程。在帕金森病中,BAG5既能发挥神经保护作用,也能促进神经元的损伤以及神经退行性疾病的发生发展。而在肿瘤中,BAG5既能发挥促癌作用,又能发挥抑癌作用。尽管BAG5的作用具有不确定性和矛盾meningeal immunity性,但是BAG5参与调控细胞增殖,细胞迁移和侵袭,肿瘤生长及化疗耐药等生物学过程。近年来BAG5的相关研究主要集中于肿瘤和神经退行性疾病,其与糖尿病视网膜病变的关系尚未见报道。本实验前期研究发现在视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)中高糖诱导BAG5蛋白表达上调,其具体原因及作用机制有待阐明。本文旨在探究高糖诱导BAG5表达上调的原因,及其调控RPE细胞发生上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及发挥促血管生成中的作用。研究方法:1、对单细胞测序数据进行分析,寻找差异表达基因和PROGENy(Pathway Resp Onsive GENes for activity inference)通路富集分析,并利用差异表达基因对细胞进行分群后为细胞信号通路活性打分。2、通过Western blot实验检测高糖培养和常糖培养ARPE19细胞中BAG5的蛋白表达水平。3、通过RT-q PCR检测高糖培养和常糖培养ARPE19细胞中BAG5的基因转录水平。4、利用慢病毒感染细胞,构建稳定敲低BAG5的ARPE19细胞系。5、构建BAG5同义突变质粒和CK2α质粒,分别转染BAG5敲低ARPE19细胞。6、通过Transwell实验检测高糖和常糖培养ARPE19细胞系的迁移能力。7、通过小管形成实验检测高糖和常糖培养ARPE19细胞系的促血管生成能力。8、通过Western blot实验检测高糖和常糖培养ARPE19细胞系中EMT标志物的表达水平。9、通过RT-q PCR实验检测高糖和常糖培养ARPE19细胞系中VEGFA的表达水平。10、通过放线菌酮实验检测BAG5敲低ARPE19细胞中CK2α蛋白稳定性的变化。11、构建含BAG5启动子区域的荧光素酶报告基因载体,利用双荧光素酶报告基因实验检测BAG5启动子活性。12、通过RT-q PCR实验检测高糖和常糖培养ARPE19细胞中转录因子Tcf7l2 Trp53 Nr3c1的表达水平。结果:1、表达BAG5的视网膜细胞和RPE细胞中EMT相关通路和VEGF相关通路的活性更高。2、高糖诱导能提高ARPE19细胞的迁移能力和促血管形成能力。3、BAG5在高糖诱导的ARPE19细胞中表达上调。4、在selleck激酶抑制剂ARPE19细胞中,敲低BAG5降低其迁移能力和促血管形成能力。5、在敲低BAG5的ARPE19细胞中回补BAG5,细胞迁移能力和促血管形成能力得到恢复。6、BAG5通过提高CK2α蛋白稳定性使CK2α表达上调,提高ARPE19细胞迁移和促血管生成能力。7、高糖诱导下BAG5启动子-1500～-1000区转录激活导致BAG5表达上调。结论:BAG5在高糖培养的ARPE19细胞中表达上调,并且BAG5高表达与增强的细胞迁移能力和促血管形成能力密切相关。本文提示BAG5通过调控CK2α蛋白稳定性,促进RPE发生EMT以及发挥促血管生成的作用。