动物性产品中药物残留是重要的食品安全问题,长期暴露会对消费者的身体健康造Baricitinib生产商成威胁。为了更好地监测动物性食品中抗生素和麻醉剂药物的残留情况,建立高效便捷的检测方法十分有必要。本研究以常见喹诺酮类抗生素、甲硝唑(MNZ)和多杀菌素(SPI),以及普鲁卡因(PRC)、丁香酚(EUG)、布比卡因(BPC)和利多卡因(LDC)麻醉剂为研究对象,从半抗原设计和合成入手,制备特异性单克隆抗体,建立免疫层析分析方法,实现了动物源性食品中药物残留的现场快速检测。(1)针对恩诺沙星(ENR)、洛美沙星(LOM)、达氟沙星(DAN)、氟罗沙星(FLE)和诺氟沙星(NOR)的高特异性抗体需求,本研究以共同结构域C-3位上的羧基作为与载体蛋白的偶联位点,同时,通过分子改造适当延长小分子药物与载体蛋白之间连接臂的长度制备抗原;MNZ的特征结构羟基和母核结构5-硝基咪唑分别被选为羧基化改造位点合成两种MNZ半抗原;通过对多杀菌素A的醚键进行水解获得羟基结构,再与琥珀酸酐反应获得含羧基的半抗原;EUG半抗原的设计和合成是基于保留酚羟基结构考虑,以香兰素为母体进行结构改造,在苯环的酚羟基对位碳链上衍生化出羧基;两种PRC半抗原被合成,一个是在PRC叔氨基上的一条碳链末端连有羧基,另一个是在PRC苯环上引入一个含碳链的羧基;BPC的半抗原是借助于N-(2,6-二甲基苯基)哌啶-2-甲酰胺六元环上的氨基进行羧基化改造获得,接入末端含有羧基的六个碳链长度连接臂;LDC的类似物3-氨基利多卡因结构本身含有活性基团,通过戊二醛的方法将小分子和载体蛋白进行偶联,从而在它们之间引入四个链长的连接臂,同时,通过重氮法制备包被抗原改善抗体检测的灵敏度。所有半抗原经LC-MS和~1H NMR鉴定证明合成成功,半抗原与载体蛋白偶联后经紫外可见光光谱和SDS-PAGE凝胶电泳鉴定证明合成成功。(2)用合成的抗原进行小鼠免疫、细胞融合和筛选、以及腹水制备和纯化得到十一种单克隆抗体,分别为高特异性的抗ENR、LOM、DAN和FLE单克隆抗体1H12、1D1、4G8和1D10,以及具有广谱特异性的抗NOR、MNZ、SPI、PRC、EUG、BPC和LDC的单克隆抗体4D7、4C4、6G9、5F12、1B5、3F3和1C5,它们的亚型分别为Ig G1、Ig G2b、Ig G2a、Ig G2a、Ig G1、Ig G1、Ig G3、Ig G2b、Ig G2b、Ig G1和Ig G2a,IC_(50)值分别为0.03μg/kg、0.12μg/kg、0.11μg/kg、0.17μg/kg、0.027μg/kg、1.1μg/kg、0.63μg/kg、0.25μg/kg、9.2μg/kg、0.84μg/kg和1.9μg/kg。4D7对培氟沙星(PEF)、LOM、氧氟沙星(OFL)、ENR、环丙沙星(CIP)和DAN的交叉反应率分别为48%、43%、38%、25%、19%和31%,4C4对地美硝唑(DMZ)和洛硝达唑(RNZ)的交叉反应率分别为65.9%和8.1%,6G9对乙基多杀菌素(Et-SPI)的交叉反应率为33.2%,5F12对氯普鲁卡因(Cl-PRC)和普鲁卡因胺(N-PRC)的交叉反应率分别为69.4%和36.8%,1B5对异丁香酚(Iso-EUG)、甲基丁香酚(M-EUG)和甲基异丁香酚(M-Iso-EUG)的交叉反应率分别为68.9%、30.1%和12.7%,3F3对罗哌卡因(RPC)和甲哌卡因(MPC)的交叉反应率分别为106%和215%。所有抗体亲和力均大于10~9 L/mol,属于高亲和力抗体,可用于免疫分析方法的建立。(3)基于制备的十一种单克隆抗体,分别建立了用于食品中抗生素和麻醉剂药物残留分析的免疫层析分析方法。具有高特异性的恩诺沙星荧光免疫层析试纸、洛美沙星荧光免疫层析试纸、达氟沙星荧光免疫层析试纸和氟罗沙星荧光免疫层析试纸对鱼肉样本中相关目标物的检测范围分别为0.17～1.7μg/kg、0.48～5.8μg/kg、0.72High-Throughput～5.7μg/kg和1.3～7.6μg/kg,同时恩诺沙星荧光免疫层析试纸对鸡蛋中禁用的ENR检测范围为0.048～0.36μg/kg。广谱特异性诺氟沙星荧光免疫层析试纸对鱼肉和牛奶中禁用的NOR、PEF、LOM和OFL检测范围分别为0.19～1.1μg/kg和0.027～0.19μg/kg、0.39～2.1μg/kg和0.049～0.34μg/kg、0.5～2.6μg/kg和0.069～0.39μg/kg、0.43～3.3μg/kg和0.06～0.41μg/kg,对制定了最大残留限量的ENR、CIP和DAN的检测范围分别为0.61～3.5μg/kg和0.089～0.65μg/kg、0.69～5.5μg/kg和0.12～0.81μg/kg、0.52～3.4μg/kg和0.09～0.52μg/kg;甲硝唑荧光免疫层析试纸对鱼肉中MNZ、DMZ和RNZ的检测范围分别为4.4～74.2μg/kg、4.8～134μg/kg和48.5～604μg/kg;普鲁卡因荧光免疫层析试纸对鱼肉样本中PRC、Cl-PRC和N-PRC的检测范围分别为0.095～0.77μg/kg、0.094～1.2μg/kg和0.21～1.74μg/Lorlatinib IC50kg;丁香酚荧光免疫层析试纸对鱼肉和水中EUG、Iso-EUG、M-EUG和M-Iso-EUG的检测范围分别为3.9～31μg/kg和4.5～48μg/kg、5.9～63μg/kg和6～67μg/kg、17～255μg/kg和17～150μg/kg、45～890μg/kg和48～709μg/kg;布比卡因荧光免疫层析试纸对鱼肉样本中BPC、RPC和MPC的检测范围分别为0.233～3.6μg/kg、0.26～3.7μg/kg和0.12～2.67μg/kg;利多卡因荧光免疫层析试纸对鱼肉样本中LDC的检测范围为0.97～10.3μg/kg;多杀菌素胶体金免疫层析试纸对鸡蛋和鸡肉中SPI和Et-SPI的检测范围分别为0.13～22μg/kg和0.13～18μg/kg、0.4～71μg/kg和0.37～50μg/kg。添加回收实验和实际样本测试结果表明本研究建立的免疫层析试纸方法具有较高的稳定性和准确性,能够用于实际样本分析。(4)本研究分别建立了用于水产品中多种麻醉剂类药物残留分析的四通道胶体金免疫层析方法和用于水产品中多种抗生素药物残留分析的五通道胶体金免疫层析方法。其中,四通道胶体金免疫层析试纸可用于鱼肉中四类共11种麻醉剂药物的分析,包括PRC、Cl-PRC、N-PRC、EUG、Iso-EUG、M-EUG、M-Iso-EUG、BPC、RPC、MPC和三卡因。五通道胶体金免疫层析试纸可用于鱼肉中五类共83种抗生素药物的分析,包括24种β-内酰胺类药物、26种磺胺类药物、5种四环素类药物、24种喹诺酮类药物和4种氯霉素类药物。添加回收测试实验和样本分析结果均表明所建立的两种方法均具有较好的准确性和稳定性,可以用作鱼肉样本中麻醉剂类药物和抗生素类药物残留高效筛查的有效手段。