心肌梗死(Myocardial infarction,MI)是临床上常见的急危重症,其人群死亡率均呈现逐年增长的趋势,心肌梗死后心肌纤维化和心力衰竭是导致患者死亡的主要原因之一。目前临床上针对心肌纤维化尚无有效的治疗药物,因此明确心肌纤维化的发病机制和寻找能够有效治疗心肌纤维化的药物具有十分重要的临床意义。大NSC 119875作用量研究证据表明,心肌梗死后的炎症在心肌纤维化的发病机制中扮演了重要的角色,因此在心肌梗死后进行抗炎治疗有可能成为改善心梗患者预后的新的治疗方向。雷公藤红素(Celastrol)是一种从雷公藤、南蛇藤等卫矛科属植物中提取出来的天然活性产物,具有很强的抗炎作用,在类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等多种疾病中都显示出了良好的治疗效果。现有的研究表明雷公藤红素具有一定的心血管保护作用,但在心肌梗死后心肌纤维化中的作用机制尚不明确。因此,为了探究雷公藤红素在大鼠心梗后心肌纤维化中的作用和可能的调控机制,本研究首先在动物水平观察和评价雷公藤红素在大鼠心肌梗死后心肌纤维化中的作用。然后通过全基因组测序分析雷公藤红素治疗心梗后纤维化相关的差异表达基因和信号通路富集,随后在体内实验中对全基因组测序结果中选定的目的基因和信号通路进行验证。最后在体外实验中通过si RNA敲低和腺病毒过表达以及应用通路抑制剂对选定的目的基因和信号通路进行验证,阐明雷公藤红素在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的新生大鼠心脏成纤维细胞(neonatal rat cardiofibroblast,NRCF)纤维化中的作用和具体分子机制。主要结果如下:一、雷公藤红素对大鼠心肌梗死后心肌纤维化和心脏功能的作用研究。心脏超声的结果显示和假手术+生理盐水组(Sham+saline组)相比,心梗+生理盐水组(MI+saline)组大鼠的LVEF(45.00±5.93 vs 83.17±4.12,P<0.001)和LVFS均显著下降(19.67±3.33 vs 47.50±4.51 P<0.001);而心梗+雷公藤红素组(MI+Celastrol组)LVEF(72.33±3.01 vs 45.00±5.93,P<0.001)和LVFS(36.67±2.73 vs 19.67±3.33,P<0.001)显著增加,提示雷公藤红素可以减轻大鼠心梗后的心功能受损。有创血流动力学检查的结果表明和Sham+saline组相比,MI+saline组大鼠的LVESP(68.88±0.03 vs 90.10±0.60,P<0.001)、+dp/dtmax(2844.70±24.06 vs 5082.54±117.49,P<0.001)和-dp/dtmax(2467.51±10.51 vs4474.87±38.13,P<0.001)等血流动力学参数明显降低,而LVEDP(18.61±0.10vs 6.40±0.14,P<0.001)明显升高。此外,H&E染结果显示雷公藤红素处理有效减轻了大鼠心肌梗死导致的病理损伤;Masson染色和天狼星红染色显示雷公藤红素处理显著减少了心肌梗死导致的胶原纤维生成和纤维化。同时,westernblot结果显示雷公藤红素处理显著减少了大鼠梗死心肌组织中与纤维化相关的CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA的蛋白表达。二、全基因组测序分析雷公藤红素在大鼠心梗后心肌纤维化过程中发挥抑制作用的基因靶点及验证。为了探究雷公藤红素究竟是通过哪些基因或者通路介导了对心肌梗死后心肌纤维化的抑制作用,我们对Sham+saline组、Sham+Celastrol组、MI+saline组和MI+Celastrol组大鼠的心肌组织进行了全基因组测序。测序结果显示与Sham+saline组相比,MI+saline组共有2147个差异表达的基因,其中表达上调的基因有1651个,表达下调的基因数496个。而MI+Celastrol和MI+saline组之间有1591个差异表达基因,表达上调的基因数为608个,下调的基因数为983个。GO和KEGG结果显示雷公藤红素处理上调了与细胞周期、p53信号通路和细胞黏附相关的通路。而雷公藤红素下调了与炎症、凋亡和程序性死亡相关的通路,如NOD样受体信号通路、NFκB信号通路和IL-17信号通路等;以及与心肌成纤维细胞增殖和胶原蛋白生成有关的通路,如JAKSTAT信号通路。我们选择NFκB/NLRP3通路进行了RT-PCR验证,结果显示大鼠心梗后NLRP3炎症小体相关基因的表达量明显增加,并且能被雷公藤红素抑制;而NFκB p65的m RNA表达量在大鼠心梗及雷公藤红素处理前后无显著变化,提示我们雷公藤红素可能通过影响p65的核易位发挥作用。三、雷公藤红素抑制大鼠梗死心肌组织中NLRP3炎症小体激活的机制研究。我们在动物水平通过免疫组化、ELISA和western-blot实验对全基因组测序分析的结果进行了验证。免疫组化结果显示与Sham+saline组大鼠相比,MI+saline组大鼠心肌组织中NLRP3和IL-1β的表达水平显著上调,并且雷公藤红素处理能够逆转二者的上调。此外,免疫组化结果显示雷公藤红素处理能够有效的降低CD68阳性的巨噬细胞和Ly6G阳性的中性粒细胞在梗死心肌组织中的浸润程度。ELISA结果显示MI+saline组大鼠血清中IL-1β和IL-18的浓度较Sham+saline组明显升高,并且雷公藤红素处理能够降低上述炎症因子的血清含量。Western-blot结果显示MI+saline组NLRP3、Cleaved-caspase1、Cleaved-IL1β和IL18的蛋白水平显著高于对照组,且雷公藤红素处理能够抑制上述蛋白表达的升高。同时,western-blot结果显示和MI+saline组相比,雷公藤红素处理使得p65的核易位减少。四、雷公藤红素通过NFκB/NLRP3途径减轻LPS诱导的NRCF纤维化的机制研究。我们用LPS诱导NRCF构建了细胞炎症模型模拟大鼠心梗后的炎症状态,通过si RNA敲低和腺病毒过表达NLRP3证实雷公藤红素能Biometal chelation够抑制心梗大鼠心肌组织中NLRP3炎症小体的表达,并且腺病毒过表达NLRP3能够抵消雷公藤红素的这种心血管保护作用。此外,我们为了探究雷公藤红素抑制NRCF中NLRP3炎症小体激活的机制Captisol和进一步验证全基因组测序的结果,我们使用了NFκB通路抑制剂BAY11-7082进行平行对照试验,western-blot结果显示雷公藤红素和BAY11-7082均能够有效的抑制NFκB通路的激活,减少p65的核易位。总之,通过以上实验充分说明雷公藤红素可能通过NFκB/NLRP3途径减轻LPS诱导的NRCF纤维化。综上所述,通过以上研究,我们明确了雷公藤红素在大鼠心肌梗死后心肌纤维化的保护作用,分析了大鼠心肌梗死造模前后以及有无雷公藤红素处理所致的基因表达差异和信号通路富集并进行了验证。我们在体内和体外水平阐明了雷公藤红素通过减少p65核易位下调NLRP3炎症小体的表达,进而减轻纤维化的作用机制,为雷公藤红素用于改善心梗后心肌纤维化和心衰防治提供新思路和新证据。