临床上,各类骨移植为骨缺损治疗的主要方式。然而,自体骨来源有限、供体部位并发症和疼痛等,限制了其广泛应用;对于同种异体骨,存在潜在的交叉感染风险;人工合成的骨替代物则成骨能力不足。因此,如何提升骨替代材料的成骨能力,是解决上述问题的有效途径。临床医生和研究者们常联合使用具有骨诱导活性的生长因子,如骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)和转化生长因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β)等促进骨替代物的成骨活性。然而,BMPs等生长因子常引起血肿和颈椎肿胀等并发症,严重影响预后效果,甚至危及生命。此外,高昂的成本也限制了这些因子的广泛应用,因此开发具有良好成骨诱导活性的替代品具有重要意义。近年来,无机离子如锶、镁、锌、铜,在骨再生领域的应用受到越来越多的研究者青睐,与BMPs等生物因子相比,无机离子被认为更加安全。另外,这些无机离子还具有易于使用、成本低、利于保存等诸多优势。研究显示锶(strontium,Sr)能促进成骨细胞分化和骨形成。然而,大规模临床试验显示,口服Sr在人体内没有显示出合成代谢作用,其中的具体原因仍不清楚。此外,高浓度的Sr可能诱发心肌梗塞等严重的心血管疾病。因此,提升Sr的成骨效能,优化Sr的给药方式,以及进一步阐明锶在骨再生中作用机制,显得尤为重要。过去几十年中,随着纳米技术的快速发展,生物活性分子的递送技术取得了很大进步。各种载体材料,如二氧化硅纳米颗粒、碳纳米管、金属有机框架、聚合物颗粒、2D纳Growth media米片等陆续被研发出来。其中超薄石墨碳氮化碳纳米片(g-C_3N_4,CN),因其具有良好的生物相容性,易于大规模制备,成本低和易于修饰等优点受到研究者们的青睐。研究显示CN基材料,由于其表面丰富的吡啶基团,可作为锚固点结合金属离子,因此是优良的递送金属离子的2D载体及功能“活化剂”。基于以上分析,本研究中利用CN超高的比表面积和丰富的表面C=N-C基团,与锶离子形成良好的配位(g-C_3N_4-Sr,CNS),不仅为增强锶离子的生物活性提供了可能,还为探究锶离子的成骨作用机制提供了新的思路。体外,本研究结果证明CNS能够快速和高效的进入细胞内;CNS主要通过非特异性巨胞饮作用和特异性网格蛋白依赖的内吞作用进入细胞;CNS体外和体内均显示出良好的生物相容性;CNS可以在非常低的单剂量下(15mg/m L)促进成骨细胞分化,并且CN和Sr显示出协同诱导成骨细胞分化作用。同样的,体内较低浓度的CNS(15mg/m L,明胶海绵吸附)即可显著促进大鼠颅骨极量骨缺损修复。机制上,研究结果表明CNS可以通过激活FAK/Rho A/Rock1通路诱导细胞内应力纤维形成,产生细胞内拉伸,从而促进成骨细胞分化。CN能够作为Sr功能“活化剂”显著提升其促骨再生效果。在第一章中,本研究采用尿素,利用直接热解法制备出块体状石墨相氮化碳,进一步通过硝酸回流法制备氧化石墨相氮化碳纳米片(CN),随后通过与氯化锶直接混合搅拌获得锶掺杂的氧化石墨相氮化碳纳米片(CNS)。此研究通过透射电子显微镜(TEM)对CNS的片层结构进行表征,通过傅里叶红外光谱仪(FT-IR)对CNS的表面结构进行表征,通过X射线光电子能谱以及荧光光谱对CNS的配位情况进行表征,通过X射线衍射仪对CNS的晶体结构进行表征。结果证明锶通过与CN表面的C=N-C基团中的氮配位结合,成功螯合在氮化碳纳米片上。在第二章中,本研究利用MC3T3-E1细胞和分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,研究CNS的细胞摄取规律;利用细胞毒性检测和细胞活死染色,评价CNS的时间和剂量依赖的细胞毒性,进而评价其细胞相容性。结果表明CNS能更多够快速和高效的进入细胞内,CNS主要通过非特异性巨胞饮作用和特异性网格蛋白依赖的内吞作用进入细胞;体内和体外结果均表明CNS具有良好的生物相容性,体内有效浓度下(15mg/m L)无明显炎症反应。在第三章中,本研究采用碱性磷酸酶活性检测评价CNS剂量和时间依赖性,筛选最佳的促骨再生浓度。另外,本研究采用RT-q PCR、碱性磷酸酶染色和茜素红染色评价CNS诱导成骨细胞分化作用。结果证明单剂量CNS的成骨效能高于持续给药,表明CN和Sr的结合可以在Belumosudil小鼠非常低的单剂量下(15mg/m L)、协同诱导成骨细胞分化。在第四章中,为了进一步探究CNS诱导成骨细胞分化机制,本研究首先采用RNA-seq检测CNS和CN刺激的BMSC基因转录谱,分析两组间显著差异表达的基因,确定可能参与调节成骨细胞分化的信号通路。进而通过RT-q PCR、WB和免疫荧光染色验证相关信号通路激活。机制上,我们通过RNA-seq鉴定出CNS可能通过激活FAK/Rho A/Rock1通路,促进成骨细胞分化。进一步RT-q PCR、WB和免疫荧光染色实验,证实CNS可以通过激活FAK/Rho A/Rock1通路诱导细胞内应力纤维形成,产生细胞内拉伸,从而促进成骨细胞分化。并且CNS激活FAK/Rho A/Rock1通路主要由其中的Sr发挥作用,本研究结果进一步丰富了Sr促进成骨细胞分化机制。在第五章中,本研究通过构建直径5mm的大鼠颅骨极量骨缺损(CSD)模型,植入吸附CNS(15mg/m L)的明胶海绵。术后6周和12周时,通过Micro CT和定量分析、H&E染色、Masson三色染色评价CNS体内促骨再生效果。结果同样证明体内CN和Sr存在协同效应,CN能够作为Sr功能“活化剂”著提升其促骨再生效果,CNS体内能够显著促进大鼠颅骨极量骨缺损修复。综上,本研究首次成功构建了Sr掺杂CN纳米片(CNS);利用CN高效的进入细胞能力,有效的将Sr递送至细胞内,显著降低了Sr使用剂量;重要的是,本研究发现CN和Sr可通过协同效应促进成骨细胞分化和骨形成,因此CN可作为Sr的功能“活化剂”,显著提升其成骨作用;机制上,此研究发现CNS可以通过激活FAK/Rho A/Rock1通路诱导细胞内应力纤维形成,产生细胞内拉伸力,从而促进成骨细胞分化。本研究表明利用二维纳米材料螯合Sr,是解决目前Sr治疗困境的潜在方案;本研究首次开发了一种基于CN的金属载药体系,为促骨再生金属纳米药物的研发提供了新思路。