肝病是世界范围内的重大健康和经济负担,随着其发病率的不断升高,肝病已经成为全球疾病和死亡的主要原因之一。在各种慢性肝病中,随着肝病的进展,肝细胞逐渐失去其强大的再生能力,并走向死亡或者衰老,进而导致肝纤维化,肝纤维化发展为肝硬化,最终可能发展为肝癌。当肝病进展到终末期时,唯一有效的治疗方法是肝移植,但移植后需要终身服用免疫抑制剂,同时供体器官匮乏意味着患者可能会在等到合适的移植器官前死亡。在临床中,确保部分肝切除和部分肝移植患者生存和良好预后的先决条件是肝再生。当部分肝切除或部分肝移植术后肝脏无法有效再生,则会引起严重威胁患者生命安全的小肝综合征。在药物和肝毒性物质等因素导致的急慢性肝损伤患者中,肝细胞有效的增殖同样是患者良好预后的重要保障。因此,建立有效的手段启动肝再生或者修复肝细胞受损的再生能力具有重要的临床意义。众所周知,肝脏具有卓越的再生能力,啮齿动物三分之二肝切除模型首次向人们展示了这种强大的再生能力。正常成体肝脏中的肝细胞大部分处于G0期,很少出现细胞分裂,然而在部分肝切除术后,约95%的肝细胞迅速重新进入细胞周期,残存的肝脏在1周左右快速恢复至原来大小。肝再生是一个多步骤、多因子、涉及多种信号相互作用精确而有序的调控过程。由于肝再生过程的复杂性,许多调控机制仍有待进一步探究。综上,阐明肝再生启动与终止的调控机制,对于阐明众多肝脏疾病(如代谢性肝病、肝硬化、肝癌等)的发病机制及其临床治疗具有极其重要的意义。因此我们尝试通过小分子组合对肝脏稳态进行精准干预,以实现对肝脏原位肝再生精确有效的调控。本课题主要包括四部分研究内容。第一部分是活性分子促进肝脏细胞原位增殖的化学筛选,结合前期的研究基础和损伤后肝再生机理的认识,我们选择转化生长因子β(Transforming growth factor-beta,TGFβ)受体抑制剂、溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)、p38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases,p38 MAPKs)抑制剂、前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)衍生物和Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)激动剂作为基础分子筛选促进肝脏中细胞原位增殖的活性分子及组合。首先是以TGFβ受体抑制剂为基础分子,筛选促进肝脏细胞原位增殖活性分子组合。我们选择以TGFβ受体抑制剂为基础分子联合肝再生过程中另外两条重要信号通路Wnt和肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)/c-Met来尝试启动肝脏中细胞增殖(该调控组合命名为LCD),结果表明抑制TGFβ、同时激活Wnt和HGF/c-Met信号通路并不能有效启动小鼠肝脏细胞的原位增殖程序。鉴于肝再生是多信号通路参与的复杂过程,因此在上述联合调控TGFβ、Wnt和HGF/c-Met信号通路基础上,我们加入了TLR7和TLR8的激动剂小分子化合物Resiquimod,结果表明小分子化合物Resiquimod的加入不能有效启动小鼠肝脏原位细胞的增殖,同时我们继续尝试在上述四分子(TGFβ受体抑制剂、HGF类似物、糖原合成酶激酶(Glycogen Synthase Kinase 3,GSK3)抑制剂以及TLR7和TLR8的激动剂)基础上加入法尼素X受体(Farnesoid X receptors,FXRs)激动剂鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA),结果表明法尼素X受体激动剂的加入也不能有效启动小鼠肝脏原位细胞的增殖。鉴于TLR受体在肝再生启动过程中的重要性以及多样性,我们用另外一种TLR激动剂S替换TLR7和TLR8的激动剂,结果表明TLR激动剂S的加入(即LCDS组合)显著提升了小鼠肝脏中Ki67阳性细胞的比例(6.27%±0.83%),我们推测TLR激动剂S可能在肝再生过程中具有重要的作用。接下来,我们继续以TGFβ受体抑制剂为基础分子分别与TLR激动剂(LS组合)、核受体激动剂(LT和LW组合)以及核因子红细胞2相关因子(Nuclear factor erythroid 2-related factor,Nrf2)激动剂diABZI STING agonist研究购买(LC组合)组合来探究其对于肝脏细胞原位增殖的影响,结果表明四组组合均不同程度提高了小鼠肝脏中原位Ki67阳性细胞比例,其中LS和LT组合阳性比例分别高达18.83%±0.92%和11.82%±1.82%。接下来是以溶血磷脂酸为基础分子筛选促进肝脏细胞原位增殖活性分子及其组合。通过筛选发现溶血磷脂酸单独给药组小鼠肝脏中Ki67阳性细胞比例仅为4.39%±0.95%,TGFβ受体抑制剂和GSK3抑制剂的分别加入反而降低了Ki67阳性细胞比例。接下来是以p38 MAPKs抑制剂为基础分子筛选促进肝细胞原位增殖的活性分子及其组合。结果显示p38 MAPKs抑制剂单独处理对小鼠肝脏原位Ki67阳性细胞比例没有显著影响,其分别与TGFβ受体抑制剂和GSK3抑制剂组合可以提高小鼠肝脏原位Ki67阳性细胞比例,但其Ki67阳性细胞比例仅仅达到2%左右。接下来是以前列腺素E2的衍生物为基础分子筛选促进肝脏细胞原位增殖的活性分子及组合。筛选结果表明前列腺素E2的衍生物处理的低剂量组可以启动小鼠肝脏原位细胞增殖程序,并且避免了高剂量组导致的肝损伤和小鼠死亡情况,其与TGFβ受体抑制剂组合并不能有效提高小鼠肝脏原位增殖细胞的比例,而与GSK3抑制剂可以显著提升小鼠肝脏中原位细胞的增殖能力,且高于单独处理的低剂量组。最后是以TLR激动剂为基础分子筛选促进肝细胞原位增殖的活性分子。基于前期筛选结果,我们推测TLR激动剂对于肝脏原位细胞增殖的启动具有重要的作用,结合相关文献的报道,我们选择TLR激动剂CR来探究小分子化合物CR对于小鼠肝脏中原位细胞增殖启动的影响。结果表明TLR激动剂CR处理组小鼠肝脏增殖细胞比例为12.66%±2.94%,显著高于对照组。综合上述筛选过程,最终我们选择TGFβ受体抑制剂和TLR激动剂S的组合(LS)、TGFβ受体抑制剂和核受体激动剂的组合(LT)、PGE2的衍生物和GSK3抑制剂的组合(dm C2)以及TLR激动剂CR作为下一步研究的小分子化合物及组合做进一步的探究。第二部分是探究活性小分子化合物及组合在非酒精性脂肪肝疾病模型中的疗效。研究表明脂肪肝会抑制正常的再生程序,因此我们尝试探究活性小分子化合物及组合在非酒精性脂肪肝疾病模型中的疗效。实验结果表明小分子化合物组合LS和LT改善了非酒精性脂肪肝小鼠模型的脂肪变性程度,但却导致了非酒精性脂肪肝模型小鼠的死亡。在非酒精性selleckchem AZD1152-HQPA脂肪肝模型小鼠中,小分子化合物组合dm C2和小分子化合物CR的处理均显著改善了模型小鼠肝脏的组织结构,降低了脂肪变性和活化的肝星状细胞的比例,促进了非酒精性脂肪肝小鼠模型肝脏中原位细胞的增殖,显著提升了模型小鼠的肝重比,同时显著改善了小鼠的肝功能指标和血脂指标。因此我们选择dm C2和CR作为重点研究的小分子化合物组合,小分子化合物组合LS和LT有待进一步地研究和优化。第三部分是小分子化合物及组合处理下肝脏的结构、功能及其毒副作用的评价。众所周知,肝损伤可以启动肝再生,因此我们评价了小分子化合物及组合对于肝脏的毒副作用,排除小分子化合物的毒副作用导致肝损伤进而启动肝再生的情况,结果显示小鼠肝脏肝小叶结构完整清晰,未见明显的损伤灶,血清肝功能指标均未超出正常值范围,即未造成明显的肝损伤及肝脏毒副作用。接下来是对小分子化合物及组合处理下肝脏功能性分子表达的评价,小分子化合物及组合处理的肝脏功能性分子肝细胞核因子4α(Hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α)和白蛋白(Albumin,Alb)没有异常变化,其与Ki67免疫荧光共染表明增殖细胞绝大部分为肝细胞,同时肝脏代谢酶细胞色素P450家族2亚家族E成员1(Cytochrome P450 Family 2 Subfamily E Member 1,CYP2E1)也未见异常变化,其与Ki67免疫荧光共染提示增殖的肝细胞可能主要分布于肝小叶Ⅱ区。接下来是对小分子化合物及组合处理条件下肝脏结构的评价,肝脏组织纤维状肌动蛋白染色表明肝细胞骨架结构完整清晰,胆小管标志物二肽基肽酶(Dipeptidyl peptidase 4,DPP4)染色显示肝脏中增殖细胞和非增殖细胞均可以检测到胆小管标志物DPP4的表达,同时Ki67分别与肝祖细胞标志物SOX9和AFP共染结果显示小分子化合物及组合处理启动了肝脏的再生程序,但未检测到肝细胞去分化为肝祖细胞的过程。最后是明确小分子化合物及组合处理条件下增殖肝细胞的肝小叶定位。Ki67和β-Catenin免疫荧光共染色提示Ki67阳性增殖肝细胞主要分布于中央静脉和门静脉之间的Ⅱ区,进一步门静脉区标志物上皮钙黏蛋白(E-cadherin,E-CAD)、中央静脉区标志物谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)和细胞增殖指标Ki67免疫荧光共染色表明小分子化合物及组合处理的实验组小鼠肝脏中增殖肝细胞以中央静脉为中心,主要定位于肝小叶中央静脉和门静脉之间的Ⅱ区。第四部分是活性分子及组合促进肝细胞增殖分子机制的初步探究。众所周知,Hippo信号通路在损伤后的肝再生中具有重要的作用,然而小分子化合物及组合处理的肝细胞特异性敲除Yap的小鼠结果表明肝细胞特异性敲除Yap并未显著降低小分子化合物及组合启动的肝脏中增殖肝细胞的比例,Yap不是小分子化合物及组合启动肝再生所必需的。接下来我们分析了小分子化合物及组合启动肝再生后转录组表达谱的变化,转录组数据表明小分子化合物组合dm C2处理实验组的差异基因中下调基因占比78.3%,富集分析数据表明小分子化合物组合dm C2处理的对照组细胞增殖负向调控通路显著富集,提示小分子化合物组合dm C2可能主要通过下调细胞增殖相关负向调控信号通路启动肝再生,与小分子化合物组合dm C2处理实验组不同,小分子化合物CR处理实验组差异基因主要为上调基因,占比90.59%,进一步富集分析数据表明小分子化合物CR处理的实验组细胞增殖相关信号通路显著Pulmonary Cell Biology富集,提示小分子化合物CR可能主要通过上调细胞增殖相关信号通路启动肝再生。对于明确的单一靶点的小分子化合物CR,我们进一步探究了小分子化合物CR同靶点化合物S是否可以同样启动肝再生,结果表明CR同靶点小分子化合物S单独处理野生型小鼠也可以显著提升小鼠肝脏中原位增殖细胞比例,提示该靶点在小鼠肝脏肝细胞原位增殖中具有重要的作用。同时对于明确的单一靶点的小分子化合物CR,我们探究了其下游分子肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)在小分子化合物CR启动肝再生中的作用,结果表明TNF-α抑制剂阿达木单抗的处理并没有显著降低小分子化合物CR处理的实验组的肝重比和肝脏中原位增殖的肝细胞数量。本研究利用野生型小鼠进行促进肝脏细胞原位增殖的活性分子的化学筛选,经过筛选获得了四组可以显著启动肝原位再生的小分子化合物及组合,对其给药时间进行优化后,我们探究活性小分子化合物及组合在非酒精性脂肪肝疾病模型中的作用。我们发现小分子化合物及组合均可以显著改善模型小鼠肝脏的组织结构和脂肪变性,但是小分子化合物组合LS和LT会导致一定比例的模型小鼠死亡,其给药时间和剂量等因素有待进一步优化,而小分子化合物组合dm C2和小分子化合物CR则不会导致模型小鼠死亡,进一步地研究表明小分子化合物组合dm C2和小分子化合物CR降低了活化的肝星状细胞的比例,促进了非酒精性脂肪肝小鼠模型肝脏中原位细胞的增殖,显著提升了模型小鼠的肝重比,同时显著改善了小鼠的肝功能指标和血脂指标。接下来我们评价了小分子化合物及组合处理下肝脏的结构、功能及其毒副作用,并进一步明确了小分子化合物及组合启动的肝脏中增殖肝细胞的肝小叶定位。最后我们对活性分子及组合促进肝细胞增殖的分子机制做了初步的探究,后续将继续深入挖掘其机制。通过本课题的研究,我们建立了有效的促进肝脏再生的化学干预手段,为肝脏再生机制的探究以及肝再生损伤等相关疾病的治疗提供新思路。