目的贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,简称Cb)是一种人畜共患菌,为医疗及畜牧业带来了极大的困扰。本项目拟解决以下三个技术或科学问题:(1)Cb现有的克隆分纯方法为琼脂糖双层半固体平板法,该方法操作技术难度大且最多只能培养7天。本研究首先建立一种可长时间培养Cb的克隆分纯方法;(2)本实验室前期通过构建p QGK穿梭载体得到了Cb内源质粒Qp H1缺失突变体,发现Qp H1是Cb感染小鼠巨噬细胞的关键毒力因子。在此基础上,本研究将筛选鉴定Qp H1编码的关键毒力基因;(3)Qp H1质粒的复制与分裂机制缺乏研究,本项目前期制备的p QGK质粒为研究上述生物学机制提供了模型。本项目将进一步深入研究与Qp H1质粒复制分裂相关的基因和DNA序列。结果(1)通过甲基纤维素半固体平板成功建立了新的Cb克隆分纯方法。利用此方法分析了不同培养方法对Cb存活率和活力的影响,发现无细胞培养与细胞培养的Cb菌有相似的存活率,但无细胞培养法菌体有较低的活力;(2)基于p QGK构建了8个Qp H1保守基因的回补载体,并成功转化进Cb质粒缺失突变体。这八个基因分别是CBUA0006、CBUA0007、CBUA0010、CBUA0011、CBUA0012、CBUA0013、CBUA0023和CBUA0027。利用转化菌感染原代BMDM细胞,发现CBUA0013是Cb感染鼠巨噬细胞的关键基因。而且,我们进一步验证了Cb质粒缺失突变体以及回补菌在ACCM2、BGM、THP-1和C57 BMDM细胞系中无明显的生长缺陷。说明质粒编码CBUA0013是Cb感染鼠原代BMDM细胞的关键基因。CBUA0013基因提前终止突变体p QGK-CBUA0013mt在原代BMDM细胞中的增殖情况与Cb质粒缺失突变体相似。在C57 BMDM细胞系中,Cb野生菌、Cb质粒缺失突变体和上述转化菌有相似的增殖能力,但只有Cb野生菌、3-MACBUA0013和CBUA0023的回补转化菌可以形成在相差显微镜下可见的Cb增殖囊泡。(3)基于p QGK载体,构建了CBUA0036-0039a基因的一系列截短突变体与提前终止突变体,转化Cb菌质粒缺失突变体和Cb野生菌。检测质粒突变体是否可以稳定转化、是否可以与內源Qp H1质粒共存,综合分析p QGK的复制与分裂机制。发现当截短突变片段包含Qp H1质粒3selleck LEE0112353nt-32930nt时内源质粒和重组质粒均能在Cb共存;CBUA0037、CBUA0038提前终止突变体中重组质粒可与内源质粒Qp H1共存,CBUA0036、CBUA0038、CBUA0039、CBUA0039a提前终止突变体中重组质粒均存在,而内源质粒Qp H1均丢失。结论(1)建立了新的Cb克隆分纯方法,发现无细胞培养与细胞培养的Cb菌有相似的存活率,但无细胞培养法菌有较低的活力,无细胞培养法获得的菌体不适用于感染实验;(2)CBUA0013基因提前终止突变体p QGK-CBUA0013mt在原代BMDM细胞中的增殖情况与Cb质粒缺失突变体相似。以上结果说明质粒编码CBUA0013是Cb感染鼠原代BMDM细胞的关键基因。(3)Cbtumor immunity菌Qp H1质粒的复制起始位点序列定位于CBUA0036-37之间;(4)CBUA0037-38基因是内源质粒Qp H1复制与分裂的关键基因;(5)多种p QGK质粒截短突变体可与内源质粒Qp H1在Cb菌中共存,为Cb研究提供了新的遗传操作工具。