目的急性心肌梗死是由急性冠状动脉阻塞引起严重心肌缺血缺氧的一种临床危重性疾病,死亡率高,进一步阐明急性心梗的机制,可为心梗的治疗提供新思路。急性心肌梗死后,内质网应激介导的自噬和凋亡水平增加,参与急性心肌梗死的发展过程。B和B1细胞特异性蛋白(Marginal zone B and B1 cell-specific protein,Mzb1)作为一种内质网相关蛋白,可与内质网应激分子伴侣热休克蛋白94(94-k D glucose-regulated protein,GRP94)结合,参与免疫蛋白的合成;同时Mzb1对小鼠急性心梗有一定的保护作用;因此,Mzb1可能参与急性心梗后内质网应激调控。葛根素来自中药葛根,具有缓解炎症、和内质网应激的作用。文献显示葛根素对实验性心肌缺血具有保护效应,本研究旨在探讨葛根素对小鼠急性心梗的保护机制,为葛根素的临床治疗提供新的依据。方法本研究包括体内与体外实验。在体内实验中选取10周龄的雄性SPF级C57BL/6小鼠,随机分为假手术组(Sham operation,Sham),急性心肌梗死组(Acute MyocBiomaterials based scaffoldsardial Infarction,AMI)和葛根素治疗组(50 mg/kg/天,100 mg/kg/天),每组各10只。适应性饲养1周后,葛根素组每天进行灌胃(50 mg/kg/天,100 mg/kg/天),连续灌胃14天,进行左冠状动脉结扎术,结扎24 h后采用小动物超声仪评估心脏功能;H&E染色比较各组小鼠心肌病理变化;DHE染色检测心脏中活性氧水平;Western blot检测内质网应激标示蛋白磷酸化-IRE1(Phospho-IRE1,p-IRE1),肌醇需求酶1(Phospho-Inositol-requiring enzyme 1,IRE1),分子伴侣热休克蛋白78(78-k D glucose-regulated protein,GRP78),转录因子C/EBP同源蛋白(Transcription factor C/EBP homologous protein,CHOP),Cleaved-Caspase3以及Mzb1的蛋白表达情况。体外实验将AC16人永生化心肌细胞随机分为溶剂对照组,H2O2模型组,葛根素组和Mzb1沉默组,MTT实验评价细胞活力,心肌细胞中氧自由基的水平用ROS染色,细胞的凋亡情况用TUNEL染色评价。Western blot检测p-IRE1,IRE1,GRP78,CHOP,Cleaved-Caspase3以及Mzb1的蛋白表达情况。结果1.体内实验:(1)心脏功能评价:与Sham组相比,AMI组左室射血分数(EF)和左室缩短分数(FS)明显降低(P<0.05),与AMI组相比,葛根素组EF和FS升高(P<0.05)。(2)TTC染色结果:与Sham相比,GefitinibAMI组小鼠心肌梗死面积增加(P<0.01);与AMI组相比,葛根素组心肌梗死面积减少(P<0.05)。(3)H&E染色结果:AMI组心肌纤维断排列紊乱甚至断裂,细胞间隙变宽,与Sham组比较;不同浓度的葛根素处理后改善肌丝排列,恢复心脏结构。(4)DHE染色结果:与Sham组相比,AMI组小鼠氧自由基水平增加;与AMI组相比,葛根素组氧自由基水平减少。(5)心肌细胞凋亡检测结果:与Sham组相比,AMI组小鼠Cleaved-Caspase3蛋白表达增多(P<0.05);与AMI组相比,葛根素组Cleaved-Caspase3蛋白表达下降(P<0.05)。(6)内质网应激相关通路蛋白检测结果:与Sham组相比,AMI组小鼠GRP78、CHOP、pIRE1蛋白表达上调(P<0.05);与AMI组相比,葛根素组GRP78、CHOP、pIRE1蛋白表达下调(P<0.05);Mzb1蛋白表达结果:与Sham组相比,AMI组Mzb1蛋白表达下降(P<0.05);与AMI组相比,葛根素治疗组小鼠心肌组织中Mzb1蛋白表达上调(P<0.05)。2.体外实验:(1)AC16心肌细胞活力评价:与对照组相比,溶剂对照组(Vehicle,Vec)和葛根素组(Puerain,Pue)无统计学差异(P>0.05);与Vec相比,H2O2组细胞活力明显下降(P<0.05),葛根素处理后细胞活力明显恢复(P<0.05)。(2)活性氧检测结果:与Vec相比,H2O2组活性氧的阳性细胞百分率升高(P<0.01),葛根素治疗后阳性细胞百分率下降(P<0.05)。(3)凋亡检测结果:TUNEL检测结果:与Vec相比,H2O2组凋亡阳性细胞百分比明显增加(P<0.05),葛根素处理后阳性细胞百分比下降(P<0.05);Cleaved-Caspase3蛋白检测结果:与Vec相比,H2O2组Cleaved-Caspase3蛋白表达显著上调(P<0.01),葛根素处理后蛋白表达下降(P<0.05)。(4)Mzb1蛋白检测结果:与Vec相比,H2O2组Mzb1蛋白表达下降(P<0.05),葛根素处理后蛋白表达明显上调(P<0.05)。(5)沉默Mzb1后AC16心肌细胞活力评估:与H2O2+葛根素组相比,H2O2+葛根素+si-Mzb1组细胞活力明显下降(P<0.05)。(6)沉默Mzb1后AC16心肌细胞活性氧检测结果:与H2O2+葛根素组相比,H2O2+葛根素+si-Mzb1组阳性细胞百分率(P<0.05)。(7)沉默Mzb1后AC16心肌细胞凋亡检测结果:TUNEL检测结果:与H2O2+葛根素组相比,H2O2+葛根素+si-Mzb1组凋亡阳性细胞百分比增高(P<0.05);CleavedCaspase3蛋白检测结果:与H2O2+葛根素组相比,H2O2+葛根素+si-Mzb1组Cleaved-Caspase3蛋白表达上调(P<0.05)。(8)沉默Mzb1后AC16心肌细胞中内质网应激相关通路蛋白检测结果:与Vec相比,H2O2组GRP78、CHOP、pIRE1蛋白表达上调(P<0.05),葛根素处理之后GRP78、CHOP、p-IRE1蛋白表达下调(P点击此处<0.05);与H2O2+葛根素组相比,H2O2+葛根素+si-Mzb1组中GRP78、CHOP、p-IRE1蛋白表达上调(P<0.05)。(9)衣霉素(TM)诱导AC16心肌细胞中Mzb1蛋白表达结果:与对照组相比,TM组中Mzb1表达明显下降(P<0.05),与TM组相比,葛根素治疗组中,蛋白表达上调(P<0.05),而这一作用被si Mzb1逆转(P<0.05);TM诱导AC16心肌细胞中内质网应激相关通路蛋白检测结果:与对照组相比,TM组中GRP78、CHOP、p-IRE1蛋白表达上调(P<0.05),葛根素治疗后GRP78、CHOP、p-IRE1蛋白表达下调,沉默Mzb1阻断了葛根素的作用(P<0.05)。结论1.急性心肌梗死降低心肌细胞保护分子Mzb1表达,增加心肌细胞的氧化应激和内质网应激,葛根素治疗可恢复心肌细胞Mzb1表达,降低心肌细胞氧化应激和内质网应激和心肌细胞损害和死亡。2.在H2O2诱导的离体心肌损伤模型中,我们进一步证实葛根素可能是通过上调Mzb1抑制内质网应激及细胞损伤。本研究为中药葛根素治疗心肌梗死的心肌保护效应提出了一个新的理论机制。