背景:牙周炎是牙周支持组织的炎症性、破坏性疾病,由牙菌斑引起的牙龈的免疫性炎症反应,导致牙周附着结构的破坏。严重的牙周炎会使患牙松动、移位甚至丧失。牙周炎在全球范围均是成人牙齿丧失的首位原因。目前对于牙周病的治疗方法主要有基础治疗、手术治疗以及药物治疗,但是都无法治愈。中药作为牙周病治疗中调节宿主免疫反应的一个辅助方法,有待于进一步的研究和发掘。目的:通过网络药理学分析,筛选苗药固齿方(MYGCF)及牙周病共同作用靶点,探究苗药固齿方在体外对于成骨细胞与破骨细胞增殖、分化以及对二者共同作用靶点RXRα表达的影响,探究苗药固齿方在体内对于大鼠牙周炎骨修复的效果,为将中药复方制剂用于临床上治疗口腔骨破坏疾病提供实验依据。方法:1.通过网络药理学分析,筛选苗药固齿方及牙周病共同作用靶点。2.煎煮及制备苗药固齿方药液、筛选苗药固齿方作用于细胞的最佳药物浓度,建立苗药固齿方作用于LPS介导下的成骨细胞和破骨细胞的炎症微环境的体外模型,通过CCK-8、Real-time q PCR、Western Blot、ALP染色、茜素红染色、TRAP染色,研究苗药固齿方对成骨细胞、破骨细胞增殖分化的作用。3.收集临床慢性牙周炎患者的牙周组织样本,通过Real-selleck合成time q PCR、Western Blot、免疫组织化学染色,检测苗药固齿方及牙周病共同作用靶点RXRα在牙周炎组织中的表达情况。4.建立大鼠牙周炎模型,通过Micro-CT、HE、IHC染色等实验,研究苗药固齿方对于骨修复的作用及其对机体的生物安全性。结果:1.网络药理学分析苗药固齿方主要有效成分以及筛选苗药固齿方与牙周炎的相交靶点苗药固齿方治疗牙周炎的核心活性成分为槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素等;关键靶点有PTGS2、PTGS1、RXRα、RELA、CASP3、PIK3CG、AKT1等;关键信号通路有AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路等;其功能主要为调节炎症反应及骨破坏等。2.苗药固齿方对成骨细胞、破骨细胞增殖分化的作用研究(1)苗药固齿方药煎液的制备及最适药物浓度筛查通过煎煮法成功制备出苗药固齿方药煎液,CCK-8结果显示苗药固齿方在1×10~(-1)g/ml时对成骨细胞、破骨细胞增殖呈现明显的抑制作用(P<0.05),在1×10~(-4)g/ml时对成骨细胞、破骨细胞增殖活性没有影响。(2)苗药固齿方作用下对成骨细胞、破骨细胞分化的影响1)成骨诱导液、成骨诱导液+苗药固齿方药液作用于MC3T3-E1细胞后,ALP染色结果显示,成骨诱导液+苗药固齿方组的胞浆内呈红色且较成骨诱导液组颜色深。茜素红结果显示,成骨诱导液+苗药固齿方组有片状的深红色钙化结节且明显多于成骨诱导液组。2)RANKL诱导液、RANKL诱导液和苗药固齿方药液作用于RAW264.7细胞后,通过光学显微镜观察发现,RANKL组出现较多的多核巨细胞,胞体较大,边缘不整齐,周围有毛刷状边缘和褶皱,有伪足,含有三个或三个以上的细胞核。RANKL和苗药固齿方组细胞形态呈现不规则形,大致呈现类圆形,细胞核数量多数为单核或者双核,多核巨细胞的数量明显低于RANKL组。TRAP染色结果显示Digital PCR Systems,RANKL组破骨细胞的褶皱和胞浆内TRAP阳性颗粒清晰可见,TRAP阳性颗粒数量明显多于RANKL和苗药固齿方组。(3)在LPS介导的炎症微环境中,苗药固齿方对成骨细胞、破骨细胞中RXRα以及成骨、破骨相关因子表达的影响1)LPS、苗药固齿方作用于成骨细胞后,Real-time q PCR结果显示,苗药固齿方组RXRα、ALP基因水平表达较空白对照组升高(P<0.05),LPS组RXRα、ALP基因水平表达较空白对照组降低(P<0.05),LPS+苗药固齿方组RXRα、ALP基因水平表达较LPS组升高(P<0.05)。Western Blot结果显示趋势同Real-time q PCR趋势相一致。2)LPS、苗药固齿方作用于破骨细胞后,Real-time q PCR结果显示,苗药固齿方组RXRα基因水平表达较空白对照组升高,Acp5基因水平表达较空白对照组降低(P<0.05),LPS组RXRα基因水平表达较空白对照组降低,Acp5基因水平表达较空白对照组升高(P<0.05),LPS和苗药固齿方组RXRα基因水平表达较LPS组升高,Acp5基因水平表达较LPS组降低(P<0.05)。Western Blot结果显示趋势同Real-time q PCR趋势相一致。3.RXRα在临床慢性牙周炎患者牙周组织中的表达Real-time q PCR结果显示,RXRα基因水平在6例慢性牙周炎临床样本中的表达低于6例健康牙周临床样本(P<0.0001)。Western Blot结果显示RXRα蛋白水平在6例慢性牙周炎临床样本中的表达低于6例健康牙周临床样本(P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示RXRα主要表达于细胞核内,在6例慢性牙周炎临床样本中的表达低于6例健康牙周临床样本(P<0.05)。4.苗药固齿方在大鼠牙周炎中对骨修复的影响(1)上颌骨的大体观显示,通过丝线和正畸结扎丝成功构建大鼠牙周炎模型。(2)龈沟探诊深度结果显示,空白对照组、牙周炎组龈沟探诊深度无明显变化,苗药固齿方组、甲硝唑组,均明显小于牙周炎组。表明苗药固齿方可以改善牙周炎的龈沟探诊深度。(3)Micro-CT 3D重建结果显示,空白组上颌第一、第二磨牙间的牙槽骨形态完整连续;牙周炎组上颌第一、第二磨牙间的牙槽骨形态呈现“深凹坑”状;苗药固齿方组上颌第一、第二磨牙间的牙槽骨形态略有降低寻找更多;甲硝唑组上颌第一、第二磨牙间的牙槽骨形态较为连续,呈现“浅凹坑”状。HE染色结果显示,苗药固齿方可以改善大鼠牙周炎的牙槽骨骨破坏,且效果优于甲硝唑。IHC染色结果显示苗药固齿方可以在体内促进RXRα以及OCN的表达以及抑制TNFα的表达。(4)大鼠肝脏、肾脏的HE染色结果显示,空白对照组、牙周炎组、苗药固齿方组、甲硝唑组的肝、肾形态表现一致,无任何器质性病变的发生。在给药期间大鼠体重均稳步提高,各组之间亦无明显变化,说明苗药固齿方在体内具有较好的生物相容性。结论:1.苗药固齿方的有效药物活性成分主要有五种,分别为槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、金合欢素。2.苗药固齿方与牙周炎主要相交靶点之一为RXRα,其有效药物活性成分均能与RXRα进行有效的结合。3.苗药固齿方通过促进RXRα和成骨相关因子的表达促进成骨细胞增殖分化,通过抑制破骨相关因子的表达从而抑制破骨细胞生成。4.苗药固齿方可促进牙周炎大鼠的牙槽骨骨修复,并具有较好的生物相容性。