致病疫霉(Phytophthora infestans)是在世界范围内能引起马铃薯和番茄晚疫病的威胁农业生产的卵菌。卵菌在遗传变异和毒力进化方面具有很高的可塑性,导致寄主基因型特异的抗病性频繁丧失,病害控制困难。利用抗病基因和抗病品种是防治作物病害最有效的策略。研究表明,致病疫霉基因组编码大量的RXLR效应蛋白(约600个),在激活寄主基因型特异性抗病性中发挥着重要作用,因此有潜力用于认识马铃薯品种的抗病性,鉴定重要的抗病遗传资源,促进马铃薯抗病育种。此外,通过探索致病疫霉致病关键的RXLR效应蛋白的毒性机制,解析作物感病的遗传基础,以期为鉴定作物抗病新基因和探索抗病新策略提供线索。本研究采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因瞬时表达方法,分析了致病疫霉16个候选核心RXLR效应蛋白在6份immunobiological supervision马铃薯抗病种质资源材料中的识别情况;分析了其中可激活马铃薯基因型特异的抗病反应的效应蛋白Pi23014的毒性功能;通过液相色谱-串联质谱(Liquid chromatograph-mass spectrometer LC-MS/MS)鉴定效应蛋白Pi23014的宿主靶标。selleckchem INCB018424主要取得以下结果:1.致病疫霉RXLR效应蛋白Pi23014通过抑制植物免疫反应促进寄主植物感病。亚细胞定位分析发现,Pi23014-CGFP定位在细胞核和叶绿体。根癌农杆菌介导的基因瞬时表达结合接菌实验结果表明,Pi23014叶绿体定位缺失突变体_(NLS)Pi23014-CGFP丧失了其促进致病疫霉侵染的能力,提示叶绿体定位是其免疫抑制功能所必需的。效应蛋白Pi23014通过上调抗氧化基因抑制病菌分子模式诱导的免疫反应(Pathogen-associated molecular patterns-triggered immunity,PTI)诱导的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)迸发,且抑制PTI标记基因表达,表明Pi23014影响转录重编程。进一步的生化分析,发现Pi23014抑制光系统II(PhotosystemⅡ,PSII)活性,诱导PSII相关基因的下调表达,进而影响光合效率。2.通过LC-MS/MS分析技术,鉴定到效应蛋白Pi23014在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中的候选靶标富含甘氨酸RNA结合蛋白Nb RBP3a。进一步利用荧光素酶互补(Luciferase complementation imaging,LCI)、酵母双杂交(Yeast two-hybrid,Y2H)、双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation,Bi FC)以及免疫共沉淀技术(Co-Immunoprecipitation,Co-IP),确认Pi23014与Nb RBP3a的互作,表明Nb RBP3a为Pi23014的靶标蛋白。3.实时荧光定量(Real-time quantitaLGX818纯度tive PCR,RT-qPCR)分析结果显示,本氏烟Nb RBP3a受致病疫霉侵染诱导表达;病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)分析结果表明,与TRV-GFP沉默植株相比,flg22处理后Nb RBP3沉默植株中WRKY7,WRKY8,PR1和PR2等多个PTI和SA防御通路标记基因的表达显著下调;根癌农杆菌介导的Nb RBP3a瞬时过表达显著增强了植物对致病疫霉的抗性,表明Nb RBP3a是植物免疫正调节因子。亚细胞定位分析结果表明,效应蛋白Pi23014和RNA结合蛋白Nb RBP3a共定位于植物细胞核。突变分析表明,Nb RBP3a的N端RNA识别基序(RNA-recognition motif,RRM)介导其与Pi23014互作,N端RRM基序缺失突变体Nb RBP3aΔN丧失了其正调控植物对致病疫霉的抗性,揭示RRM基序可能参与Nb RBP3a的免疫功能。4.通过检测光系统II的荧光参数最大量子产率(Maximum quantum yield,Fv/Fm),电子传递速率(Electron transport rate,ETR),非光化学猝灭(Non-photochemical quenching,NPQ),PSII量子产额(PSII quantum yield,Y(II))和PSII的QA电子受体的氧化还原状态(the redox state of the QA electron acceptor of PSII,1-qP),发现Nb RBP3沉默植株的PSII活性显著降低。这些结果表明,Nb RBP3a功能的丧失导致叶绿体功能障碍。综上所述,本研究揭示了致病疫霉在侵染植物的过程中,利用其核心RXLR效应蛋白Pi23014靶向宿主叶绿体和细胞核,与RNA结合蛋白Nb RBP3a互作,来抑制PSII活性和叶绿体介导的植物防御机制。我们的研究结果还表明,保护光系统II免受病原菌效应蛋白的影响可能是一种植物对抗致病疫霉的新策略。