猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)是一种重要的人兽共患病原菌,不仅对养猪业造成巨大的经济损失,也严重威胁着公共卫生安全。其感染后可诱发脑膜炎、心内膜炎、关节炎和败血症等症状,其中尤以脑膜炎最为严重,然而病原与宿主互作诱发脑膜炎的机制尚不清楚。本课题组前期通过SS2全基因组噬菌体随机展示文库与体外血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)模型之间的相互作用,筛选出了14种可能在SS2破坏BBB过程中发挥作用的毒力因子,胶原酶样蛋白酶(Collagenase-like protease,Clp)是其中之一。该蛋白被鉴定为U32肽酶家族假定的胶原酶,目前Clp在SS2突破BBB诱发脑膜炎中作用尚未见相关报道,为此,本研究针对Clp在SS2脑膜炎发生中的作用及机制开展了以下工作:1.通过原核表达,成功诱导表达纯化出高纯度、可溶性的SS2重组蛋白r Clp。利用同源重组技术,构建出SS2 SC19的Clp基因缺失菌株ΔClp及其回补菌株CΔClp,生长速度测定及细菌形态观察发现,与野生株相比,缺失菌株的生长速度无显著变化,但细菌链长变短。2.为阐明Clp在SS2感染机体入侵BBB中的作用,通过小鼠感染模型,比较野生株与缺失株在毒力、组织定殖情况等方面的差异,结果发现,Clp基因的缺失显著增加了小鼠的存活率,降低了细菌在血液和各组织器官的定殖能力以及对脑、肺组织的病理损伤。体外构建h CMEC/D3单层BBB模型,细胞跨膜电阻(Trans epithelial electric resistance,TEER)的测定结果显示重组蛋白r Clp可显著增加单层屏障的通透性;Clp基因缺失后,SS2对单层屏障的破坏作用显著下降;伊文氏蓝(Evans blue,EB)含量及穿越模型的菌量也显示出相同的结果。小鼠体内实验发现,oncology (general)Clp基因缺失后,SS2感染小鼠脑组织EB含量显著降低,而r Clp的预先处理,增加了SS2感染后脑EB的含量。3.为了探究Clp破坏BBB的作用机制,本研究通过细菌黏附实验,发现Clp可显著促进SS2对h CMEC/D3的黏附;通过WB检测重组蛋白r Clp及ΔClp菌株作用于h CMEC/D3后细胞间紧密连接蛋白的表达水平,发现Clp可显著抑制细胞间紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达;另外,通过RT-PCR、Annexin-Ⅴ/PI双染及WB等方法分MLN4924分子式析重组蛋白r Clp及ΔClp菌株刺激内皮细胞的凋亡情况,结果发现Clp可能通过线粒体凋亡途径和细胞受体配体凋亡途径诱导h CMEC/D3发生凋亡,且两条途径独立进行。4.通过Pull down、质谱分析、流式细胞术等技术,鉴定与Clp互作的h CMEC/D3的蛋白,结果显示PABPC1和G3BP1蛋白可能是其互作蛋白。综上,本研究结果表明Clp是一个新的候选毒力蛋白,参与SS2的致病过程,通过促进细菌的黏附,诱导脑微血管内皮细胞凋亡,抑制细胞间紧密连接的表达,从而破坏BBB增加其通透性。其与细胞互作蛋白可能为PABPC1和G3BP1。本研究进一步揭示了SS2突破BBB,诱Gefitinib发脑膜炎的致病机理,为更好的治疗和预防SS2诱导的脑膜炎提供了理论基础。