奶牛产后子宫感染常引发子宫炎和子宫内膜炎,造成炎症和氧化损伤,损害奶牛生殖性能,影响奶牛养殖业发展。临床常见病因包括奶牛围产期代谢紊乱、产犊异常、微生物污染。大肠杆菌作为主要致病源之一,通过其外膜上的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)发挥致病作用。Toll 样受体 4(toll like receptor 4,TLR4)识别LPS并激活核因子κ-B(nuclearfactorkappa-B,NF-κB)信号通路,造成下游炎症因子升高,并伴随着活性氧自由基(reactive oxygenspecies,ROS)的产生。当ROS的产生远超过机体的抗氧化清除能力时,脂质、蛋白质和DNA就会受到破坏,造成氧化应激。美洛昔康(meloxicam,MEL)是一种选择性环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂,与抗生素联合使用可以缓解产后子宫炎症并镇痛。研究表明,MEL具有抗氧化和抗炎作用。然而,MEL与奶牛子宫炎症和氧化应激之间的联系尚未报道。本试验旨在探究MEL(0.5或5 μM)对LPS(1 μg/mL)刺激的原代奶牛子宫内膜上皮细胞(bovine endometrial epithelial cells,BEEC)氧化应激和炎性反应的作用机制,为临床合理应用MEL缓解奶牛子宫炎症提供理论依据。1.MEL对LPS诱导的BBEC氧化应激的影响为明确MEL对LPS诱导的BEEC氧化损伤相关指标的变化,采用不同浓度MEL(0.5或5 μM)单独或与LPS共处理细胞12 h,检测细胞ROS和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活力及总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)。结果表明:MEL单独处理对细胞氧化损伤指标和抗氧化酶活性的无显著影响(P>0.05);LPS刺激导致ROS和MDA含量升高(P<0.05或P<0.01);与LPS组相比,MEL的加入降低了 ROS和MDA含量(P<0.05或P<0.01),5 μMMEL效果更为显著。说明MEL可以通过降低ROS和MDA含量,提高抗氧化酶活力来减轻LPS诱导的BEEC氧化损伤。为探究MEL对LPS诱导的BEEC核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor2,Nrf2)通路及氧化相关细胞因子表达的变化,采用不同浓度MEL(0.5或5 μM)与LPS共处理细胞6、12、24h,荧光定量PCR检测CAT、GPX1、SOD1、诱导型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase 2,NOS2)和环氧合酶 2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)基因表达;采用不同浓度 MEL(0.5 或 5μM)单独或与LPS共处理细胞90 min,Western Blot检测Nrf2通路关键蛋白表达,免疫荧光技术检测Nrf2入核情况。结果显示:与对照组相比,LPS组在6、12和24 h时CAT和GPX1的基因表达均降低(P<0.05或P<0.01),SOD1仅在6h时基因表达降低(P<0.01),NOS2和PTGS2在6、12和24h时基因表达均升高(P<0.05或P<0.01);与LPS组相比,MEL与LPS共处理组在6、12和24 h时CAT、GPX1和SOD1的表达增加(P<0.05或P<0.01),NOS2的表达下降(P<0.05或P<0.01),在12和24 h时PTGS2表达下降;MEL单独处理对Nrf2信号通路的蛋白表达无影响(P>0.05);LPS刺激导致Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达下降(P<0.05),Keap1蛋白表达升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS和MEL共处理组Nrf2、HO-1和NQO1的表达均上升(P<0.05 或P<0.01),Keap1 蛋白表达降低(P<0.05 或P<0.01);LPS 和 MEL 共处理促进了(P<0.01)Nrf2入核。说明MEL可以通过激活Nrf2通路,促进相关抗氧化酶基因表达、抑制NOS2和PTGS2基因表达来抵御LPS诱导的BEEC的氧化损伤。2.MEL对LPS诱导的BEEC炎性反应的影响为明晰MEL对LPS诱导的BEEC NF-κB通路及炎性细胞因子表达的影响,采用不同浓度MEL(0.5或5 μM)与LPS共处理细胞3、12和18h,RT-qPCR检测TLR4、髓样分化因子(myage of infectioneloiddifferentiationfactor88,MyD88)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL6、CXC 趋化因子 8(C-X-C motifchemokine ligand 8,CXCL8)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)的基因表达;不同浓度MEL(0.5或5 μM)单独或与LPS共处理细胞30 min,Western Blot检测NF-κB通路关键蛋白表达,免疫荧光技术检测p65入核情况。结果显示:LPS在3、12和18h刺激了TLR4、M购买AM-2282YD88、IL1B、IL6、CXCL8和 TNF的基因表达(P<0.05 或P<0.01);MEL 抑制了(PErastin体内实验剂量<0.05 或P<0.01)LPS诱导的MYD88、IL1B、IL6、CXCL8和TNF的基因表达,但对TLR4基因表达无影响(P>0.05);单独MEL对p65和IκBα磷酸化均无影响(P>0.05);LPS诱导(P<0.01)p65和IκBα磷酸化,促进(P<0.01)p65入核;与LPS组相比,LPS和MEL共处理组降低了(P<0.05或P<0.01)p65和IκBα磷酸化水平和p65的入核数量(P<0.05或P<0.01)。说明MEL可以通过抑制NF-κB通路及其下游炎性细胞因子的表达抵御LPS诱导的BEEC的炎性反应。综上,MEL分别通过激活Nrf2通路和抑制NF-κB通路,抑制LPS诱导的BEEC氧化应激和炎性反应。