目的:从体内动物和体外细胞实验两方面实验探讨糖酵解在苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene,B[a]P)在活化小胶质细胞(Microglia,MC)致小鼠认知功能障碍中的作用,为B[a]P神经毒性机制的研究提供一定的科学依据。方法:体内研究:将50只成年雄性无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)级ICR小鼠按体重随机分为溶剂对照组(花生油),2.5、5、10 mg/kg B[a]P染毒组,10 mg/kg B[a]P+2-脱氧-D-葡萄糖(2-Deoxy-D-glucose,2-DG)干预组,共五组,每组10只。染毒组小鼠采用灌胃方式给予B[a]P,溶剂对照组根据小鼠体重给予等体积花生油灌胃,隔天1次,连续染毒45次,共90天。干预组小鼠通过口服饮用水方式摄入2-DG药物,浓度为0.03%2-DG。每日新malignant disease and immunosuppression新鲜配制2-DG饮用水。染毒结束后,采用洞板实验、T迷宫实验、爬杆实验、自我捋毛实验和Morris水迷宫实验综合评价小鼠的认知功能水平,通过透射电镜拍摄小鼠小胶质细胞的形态变化,采用葡萄糖含量试剂盒检测小鼠皮质葡萄糖含量。利用免疫印迹法分别检测小鼠大脑皮质Iba-1、GLUT1、HK-2、PKM-2、HIF-1α及LDHA蛋白的表达。体外实验:使用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基培养BV2细胞。当BV2细胞生长至对数生长期,将BV2细胞随机分为5组,分别是DMSO对照组,0.2、2、20μM B[a]P染毒组,20μM B[a]P+80μM 2-DG干预组。染毒前将细胞培养基更换为DMEM低血清培养基(含3%胎牛血清),用DMSO或B[a]P染毒液处理,干预组在接受B[a]P染毒处理的同时,加入经PBS稀释的2-DG溶液。37oC、5%CO_2继续培养24 h后,倒置显微镜下观察细胞的形态学改变,CCK—8法检测细胞活力改变情况,葡萄糖含量试剂盒检测BV2细胞葡萄糖含量;利用Agilent SeahorseStaurosporine体内实验剂量 XFP仪器检测基础糖酵解能力、细胞利用糖酵解达到的最大产生能量的能力和糖酵解储备能力;Western Blot法检测细胞Iba-1、GLUT1、HK-2、PKM-2、HIF-1α和LDHA蛋白表达。结果:体内实验结果显示,随着B[a]P染毒剂量增加,高剂量B[a]P组小鼠反应缓慢,毛发光泽度降低、干枯易脱落,背部、颈部以及腹腔内可见黄色脓肿,体重显著下降。与溶剂对照组比较,2.5、5和10 mg/kg B[a]P组小鼠洞板实验时间和次数显著降低(P<0.05),T迷宫正确率显著下降(P<0.05),爬杆实验中从顶部爬到底部的时间显著增加(P<0.05),自我捋毛实验时间显著增加(P<0.05);10.0 mg/kg B[a]P染毒组水迷宫逃避潜伏期升高、穿越平台次数和目标象限停留时间显著降低(P<0.05)。提示B[a]P染毒可损害小鼠认知能力。透射电镜显示随着B[a]P剂量增加,小鼠海马中小胶质细胞核逐渐变形,体积缩小,与细胞质之间存在空泡;大脑皮质Iba-1表达显著增加(P<0.05),提示B[a]P可活化小鼠小胶质细胞。葡萄糖含量检测表明,与溶剂对照组相比,B[a]P染毒后小鼠皮质葡萄糖水平显著下降(P<0.05)。Western blot结果表明,与溶剂对照组相比,各B[a]P染毒处理组小鼠皮质PKM-2、LDHA蛋白均表达增加(P<0.05),10.0 mg/kg B[a]P染毒组的GLUT1、HK-2、HIF-1αdiABZI STING agonist说明书表达增加(P<0.05)。干预后,与B[a]P染毒组相比较,10 mg/kg B[a]P染毒+2-DG组小鼠认知功能障碍减轻;小鼠海马中的小胶质细胞核完整、线粒体结构完整。小鼠大脑皮质中Iba-1蛋白表达显著下降(P<0.05),糖酵解途径GLUT1、HK-2、PKM-2、HIF-1α及LDHA蛋白的表达显著降低(P<0.05),小鼠大脑皮质葡萄糖水平明显升高(P<0.05)。小胶质细胞作为中枢神经系统内的关键免疫细胞,其作用像是一把双刃剑,被短暂活化可促进神经元的生长,但在慢性刺激中被持续活化可引起神经炎症反应,造成神经元和组织的损伤,小胶质细胞在大脑中的作用不亚于神经元。研究小胶质细胞活化的原因对于B[a]P导致认知功能障碍的预防具有很大的科学意义。体外研究结果显示,B[a]P染毒后,细胞数量逐渐减少,细胞聚集生长,细胞碎片增多,形态从正常的哑铃状向阿米巴样转变。与DMSO组比较,高剂量B[a]P染毒组细胞活力显著降低(P<0.05);Western blot结果表明,与DMSO对照组相比较,各B[a]P染毒组Iba-1蛋白表达均显著增加(P<0.05),提示B[a]P染毒后可活化BV2细胞。葡萄糖含量检测结果表明,与DMSO组比较,各染毒组葡萄糖水平均显著下降(P<0.05)。糖酵解压力实验显示,与DMSO对照组相比较,20.0μM B[a]P染毒组的基础糖酵解能力、利用糖酵解达到最大产生能量的能力、糖酵解储备值均明显升高(P<0.05)。与DMSO对照组相比较,20.0μM B[a]P染毒组HK-2、PKM-2、HIF-1α及LDHA蛋白表达增加(P<0.05),所有染毒组GLUT1蛋白表达均显著增加(P<0.05),表明B[a]P可能通过糖酵解途径活化BV2细胞。经2-DG干预后,延缓了B[a]P诱导BV2细胞的阿米巴样形态转变,与20.0μM B[a]P组比较,干预组BV2细胞活力显著升高(P<0.05);细胞内葡萄糖含量明显增加(P<0.05);Seahorse实验结果表明干预组细胞的基础糖酵解能力、利用糖酵解达到最大产生能量的能力、糖酵解储备值均明显降低(P<0.05);Western blot结果表明Iba-1蛋白表达显著下降(P<0.05)。糖酵解相关蛋白GLUT1、HK-2、PKM-2、HIF-1α及LDHA表达显著降低(P<0.05)。结论:1.糖酵解在B[a]P致小鼠认知功能障碍和小胶质细胞活化中起重要的作用,具体机制可能与糖酵解途径相关蛋白GLUT1/HK-2/PKM-2/HIF-1α/LDHA的激活有关。2.抑制糖酵解对B[a]P诱导的小胶质细胞活化及认知功能障碍具有明显的改善作用。