研究背景近期研究表明自噬抑制剂(Autophagy inhibitor)可增敏肿瘤化疗药物达到抑制肿瘤细胞增殖的作用,但目前为止,大多数自噬抑制剂仅作为研Q-VD-Oph究工具使用,应用于临床实践的自噬抑制剂biomarker discovery种类较少,主要为氯喹及其衍生物羟氯喹。寻找新的肿瘤细胞自噬抑制剂,研究其作用机制,对开发新的肿瘤化疗药物增敏剂具有很重要的意义。越来越多的研究表明我国传统中药中提取的有效成分可作为肿瘤细胞自噬抑制剂,且具有高效、低毒的优点。粉防己碱Dinaciclib配制(Tetrandrine),又名汉防己甲素,是一种从传统中药汉防己的根中提取的生物碱,已在临床应用多年,主要用于高血压的治疗,其毒副作用较小。我们研究发现粉防己碱可抑制多种肿瘤细胞的自噬降解,粉防己碱抑制胃癌细胞自噬体-溶酶体融合,并增敏长春新碱抑制胃癌细胞增殖。然而,粉防己碱抑制胃癌细胞自噬体-溶酶体融合及增敏长春新碱抑制细胞增殖的机制仍不清楚。在本项研究中,我们研究了粉防己碱抑制自噬降解及增敏长春新碱抑制胃癌细胞增殖的作用机制。研究目的阐明粉防己碱抑制自噬降解并增敏长春新碱抑制胃癌细胞增殖的作用机制,开发一种新型肿瘤化疗药物增敏剂,以期为治疗胃癌提供一种新的治疗策略。研究方法Western blot检测自噬、细胞凋亡和细胞周期相关蛋白的表达;共聚焦显微镜观察细胞自噬流的改变、自噬体和溶酶体的共定位,以及线粒体的形态;免疫沉淀法检测蛋白质之间的相互作用;MTT实验和结晶紫实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期;透射电子显微镜检测细胞中自噬体的改变。研究内容与结果1.粉防己碱抑制胃癌细胞自噬降解粉防己碱可抑制多种肿瘤细胞自噬降解,导致胃癌SGC-7901/VCR细胞中自噬体增加及自噬相关蛋白P62、LC3B表达增多,其作用效果与自噬抑制剂巴弗洛霉素A1类似,而与自噬诱导剂雷帕霉素的作用相反。双荧光LC3质粒转染实验证实粉防己碱阻断胃癌SGC-7901/VCR细胞自噬降解过程。2.粉防己碱抑制胃癌细胞自噬体-溶酶体融合质粒转染实验及蛋白免疫共沉淀实验发现,粉防己碱阻碍SNAP29与VAMP8的结合,从而干扰SNARE蛋白复合物形成,抑制胃癌SGC-7901/VCR细胞自噬体-溶酶体融合,抑制自噬降解。3.粉防己碱增敏长春新碱抑制胃癌细胞增殖MTT实验检测发现粉防己碱可增敏长春新碱抑制胃癌SGC-7901/VCR细胞、食管癌EC-109/VCR细胞的增殖,增敏多柔比星抑制胃癌SGC-7901/ADR细胞、人髓性白血病K562/ADR细胞的增殖。流式细胞术及Western blot检测发现粉防己碱可增敏长春新碱诱导胃癌SGC-7901/VCR细胞发生凋亡并激活细胞凋亡途径。进一步研究发现胃癌SGC-7901/VCR细胞凋亡与自噬体的过度堆积密切相关。4.粉防己碱增敏长春新碱影响胃癌细胞MAPK信号通路及细胞周期Western blot检测发现长春新碱与粉防己碱联合增加胃癌SGC-7901/VCR细胞中p38和JNK的磷酸化水平,减少ERK的磷酸化水平。应用p38或JNK抑制剂预处理SGC-7901/VCR细胞后减弱联合用药诱导凋亡的作用(P<0.01),而应用ERK抑制剂预处理后增强联合用药诱导凋亡的作用(P<0.01)。流式细胞术及Western blot检测发现联合用药导致胃癌SGC-7901/VCR细胞发生S/G_2细胞周期阻滞。结论1、粉防己碱是多种肿瘤细胞自噬降解的抑制剂。它可阻碍SNAP29与VAMP8结合,干扰SNARE蛋白复合物形成,从而抑制胃癌SGC-7901/VCR细胞自噬体-溶酶体融合,抑制自噬降解,最终导致自噬体堆积。2、粉防己碱可增敏多种肿瘤化疗药物,粉防己碱协同长春新碱导致大量自噬体在胃癌SGC-7901/VCR细胞内过度堆积,激活MAPK信号通路的p38和JNK通路,抑制ERK通路,激活凋亡途径,导致胃癌SGC-7901/VCR细胞线粒体损伤、细胞周期阻滞、细胞凋亡,从而抑制细胞增殖。