研究目的:甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)常被用于治疗类风湿性关节炎,急性白血病和银屑病等,治疗过程中可能会引起某些副作用,例如骨髓抑制,但其引发骨髓抑制的具体分子机制尚不清楚。Notch信号通路被认为是调节造血干细胞(Strategic feeding of probiotichematopoietic stem cell,HSC)再生和动态平衡的重要途径,并且在促进骨髓造血功能方面扮演了重要角色。针对MTX所引起的骨髓抑制,其报道主要停留在临床观察上。本课题围绕MTX对Notch信号通路的调控作用进行探究,旨在为临床治疗中缓解MTX诱导的骨髓抑制提供新思路和新策略。研究方法:(1)利用MTX处理后的小鼠原代骨髓细胞,采用CCK8(Cell counting kit 8 assay)试剂盒检测MCX-5461TX对细胞毒性的影响;MTX处理细胞后,利用RT-qPCR方法分析MTX对几个最常见造血相关信号通路关键成员mRNA水平的影响,与对照组相比,筛选出受MTX调控的信号通路;利用Western Blot方法分析MTX对Notch1蛋白水平的影响;采用RT-qPCR方法进一步分析MTX对Notch信号通路其他成员的影响。(2)分别给予不同浓度,不同时间MTX处理细胞后,利用Western Blot方法分析MTX对Notch信号通路负调控因子Numb蛋白水平的影响;采用RT-qPCR方法分析检测MTX对Numb mRNA水平的影响。(3)过表达Flag-Numb后,利用CHX(Cycloheximide,蛋白合成抑制剂)分析MTX是否影响Numb稳定性;采用免疫沉淀和Western Blot方法分析MTX对Numb蛋白泛素化水平的影响以及泛素化类型。(4)利用PR-619处理细胞,通过Western Blot方法分析MTX调控Numb是通过E3还是DUBs途径;结合Ubibrowser E3预测数据库分析潜在泛素蛋白连接酶,采用免疫共沉淀(co-IP)技术以及Western Blot方法探究筛选出的E3对Numb蛋白水平的调控;进一步分析两者之间的相互作用;给予MTX处理细胞,利用Western Blot方法分析MTX是否干扰E3泛素蛋白连接酶与底物Numb之间相互作用。(5)分别利用7种临床常用的抗炎中药单体药物处理细胞,采用Western Blot方法筛选出下调Numb蛋白水平的药物雷公藤甲素(Triptolide,TPL);分析鉴定TPL对细胞内源性蛋白Numb,Notch1表达水平的影响;进一步利用RT-qPCR方法分析TPL对Notch信号通路其他成员的影响;CCK8实验探究TPL对小鼠骨髓原代细胞毒性的影响;将MTX与TPL联合作用,采用Western Blot及RT-qPCR方法检测TPL是否能缓解由MTX对Notch信号通路带来的负面影响;通过CCK8实验研究两种药物联用对细胞毒性的影响。研究结果:(1)CCK8实验结果selleckchem GSKJ4显示MTX对细胞具有明显毒作用;不同浓度MTX处理不影响内源性Smad2及Ptch1 mRNA水平,但显著降低内源性Notch2 mRNA水平;进一步研究发现MTX下调Notch信号通路受体,配体及下游靶基因表达,抑制Notch信号通路。(2)在小鼠原代骨髓细胞及RAW264.7细胞中,与对照组相比,MTX显著上调Notch信号通路负调节因子Numb蛋白水平,此作用呈剂量依赖性和时间依赖性;RT-qPCR结果显示,MTX不影响Numb转录表达。(3)MTX减缓Numb的降解速度;MTX下调Numb的多聚泛素化水平,其调控Numb泛素化类型是K48类型泛素化;(4)MTX通过E3途径调节Numb蛋白水平;E3泛素蛋白连接酶Nedd4与Numb之间存在相互作用,通过促进Numb发生K48类型多聚泛素化修饰,实现降解Numb蛋白水平的目的;MTX限制Nedd4介导的Numb蛋白水平的下调;MTX明显抑制Nedd4诱导的Numb蛋白泛素化水平的上调;MTX阻碍Nedd4与Numb的相互作用,抑制二者结合。(5)采用Western Blot方法从7种临床常用抗炎中药单体中筛选出下调Numb蛋白水平的药物TPL;TPL上调Notch1蛋白水平;TPL上调Notch信号通路受体,配体及下游靶基因表达,激活Notch信号通路;TPL浓度为1nM时处理细胞48 h,对小鼠骨髓细胞无明显毒性作用;MTX与TPL联合用药可缓解MTX对Numb蛋白的促进作用以及对Notch信号通路的抑制作用;TPL与MTX联用可削弱MTX造成的细胞毒性。研究结论:本研究提供了 MTX强烈抑制Notch信号通路的证据。我们发现MTX抑制了Nedd4与Numb之间的相互作用,从而限制了 Numb K48类型的多聚泛素化,稳定了Numb蛋白水平,进而通过下调Notch1表达来抑制Notch信号传导。有趣的是,我们发现了一种单体药物TPL,它能够减轻MTX对Notch信号通路的抑制作用。这项研究进一步加深了我们对MTX介导的Notch信号通路调控的理解,因此有望为在临床治疗中缓解MTX引起的骨髓抑制提供一种潜在思路。