甘露寡糖(Mannan oligosaccharides,MOS)是一种常见的益生元,因其优异的抗氧化特性和免疫刺激作用,常作为功能性饲料添加剂,在畜禽和水产养殖中广泛应用。本研究首先通过生长试验考察MOS对草鱼(Ctenopharyngodon idella)肠道生长发育、肠道菌群、短链脂肪酸和肠道消化吸收功能影响及可能机制;第二,通过建立攻毒模型,考察MOS对肠道结构和免疫屏障功能影响及可能机制;第三,通过体外试验,以草鱼原代肠道上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)和原代肠道巨噬细胞(Macrophage,MΦ)为研究对象,建立免疫应激模型,考察MOS对肠细胞增殖和免疫调节的影响,进一步揭示MOS调控草鱼肠道免疫屏障功能的作用机制。主要研究内容和结果如下:1.MOS对草鱼肠道生长发育、消化吸收功能和健康指数的影响试验选取540尾健康草鱼(215.85±0.30 g)进行60天生长试验,共设6个处理组(MOS添加水平分别为:0、200、400、600、800和1000 mg/kg),每个处理组3个重复,每个重复30尾草鱼。结果表明,饲粮添加不同水平的MOS能显著增加草鱼肠道长度、皱襞高度、肝胰脏、肠道、头肾和脾脏的重量及相关健康指数(P<0.05),促进草鱼功能器官的生长发育;增加肠道双歧杆菌和乳酸杆菌的数量、丙酸和丁酸的含量(P<0.05),降低大肠杆菌和嗜水气单胞菌的数量以及乙酸的含量(P<0.05),优化草鱼肠道菌群和短链脂肪酸的生成,其中以400 mg/kg MOS组效果最佳。饲粮添加不同水平的MOS能显著增加草鱼肝胰脏和肠道的糜蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力(P<0.05),增加不同肠段的刷状缘酶活力(P<0.05),促进草鱼肠道的消化和吸收能力;能上调前、中和后肠阴离子氨基酸转运载体(SLCA2α和SLC1A3)、阳离子氨基酸转运载体(SLC7A1)、中性氨基酸转运载体(SLC1A5、SLC7A5和SLC7A8等)和阳离子和中性氨基酸转运载体(SLC7A6、SLC7A7和SLC7A9等)的m RNA水平(P<0.05),促进草鱼肠道对氨基酸的转运;上调前、中和后肠的TOR的m RNA水平和蛋白水平(P<0.05),结果说明MOS促进草鱼肠道氨基酸转运可能与TOR信号途径的激活有关。2.攻毒条件下,MOS对草鱼肠道结构和免疫屏障功能的影响在试验一基础上,试验二建立了嗜水气单胞菌攻毒模型,每个处理组选取15尾体重接近的健康草鱼,进行腹腔注射嗜水气单胞菌,攻毒时间为14天,探索了MOS对草鱼肠道结构和免疫功能的影响及作用机制。2.1攻毒条件下,MOS对草鱼肠道抗氧化能力的影响结果表明,饲粮添加不同水平的MOS能显著降低草鱼前、中和后肠活性氧水平、丙二醛和蛋白质羰基含量(P<0.05),提高前、中和后肠Cu Zn SOD、CAT、GST、GR和GPx的酶活力和m RNA水平(P<0.05),进而提高草鱼肠道抗氧化损伤能力,其中大部分指标以400 mg/kg MOS组效果最佳;进一步研究发现,饲粮添加不同水平的MOS显著上调PKCδ和Nrf2的m RNA水平和蛋白水平(P<0.05),说明MOS可能通过MR/PKCδ/Nrf2/Keap1信号途径调控草鱼肠道抗氧化能力。2.2攻毒条件下,MOS对草鱼肠道结构完整性的影响结果表明,饲粮添加不同水平的MOS能降低二胺氧化酶和D-乳酸的含量(P<0.05),保护草鱼肠道结构完整性;上调ZO-1、Occludin和Claudin-b等紧密连接蛋白和JAMA、E-cadherin和α-catenin等黏附连接蛋白的m RNA水平、ZO-1和Occludin的蛋白水平(P<0.05),说明MOS能增强草鱼肠道顶端连接复合体的结构完整,其中大部分指标以400 mg/kg MOS组效果最佳。饲粮添加不同水平的MOS能显著下调MLCK、Rho A、ROCK和NMII的m RNA水平和Rho A的m RNA和Rho A的蛋白水平(P<0.05),说明MOS可能通过抑制MLCK和Rho A/ROCK信号调控顶端连接复合体蛋白表达,从而保护IECs之间结构完整性。2.3攻毒条件下,MOS对草鱼肠道免疫屏障功能的影响结果表明,饲粮添加不同水平的MOS还能显著降低草鱼肠炎发病率(P<0.05),提高草鱼前、中和后肠溶菌酶和ACP活力和补体C3、C4和Ig M的含量(P<0.05),上调C1、C2和C3等补体分子的m RNA水平(P<0.05),上调β-defensi-1、Hepcidin和LEAP-2A等抗菌肽的m RNA水平(P<0.05),说明MOS能提高草鱼肠道非特异性免疫力,其中大部分指标以600 mg/kg MOS组效果最佳;进一步研究发现,饲粮添加不同水平的MOS能下调TNFα、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子和上调IL-10、TGF-β1和IL-4/13B等抗炎细胞因子m RNA水平(P<0.05),说明MOS能抑制肠道的炎症反应,其中大部分指标以600 mg/kg MOS组效果最佳;此外,饲粮添加不同水平的MOS能显著下调草鱼前、中和后肠TLR2、TLR5、NF-κBp65、c-Rel、IKKβ和IKKγ等受体及相关信号分子的m RNA水平,下调My D88、TRAF6、IRAK1和NF-κBp65等信号分子的m RNA水平和蛋白水平(P<0.05),但对TLR1、TLR4、TRIF、NF-κBp52和IKKα的m RNA水平无影响(P>0.05),说明MOS可能通过调控TLR2/5/NF-κBp65信号(而不通过TLR1和TLR4)途径缓解草鱼肠道炎症反应。3.MOS对草鱼肠道细胞免疫功能的影响及可能机制试验二的结果表明,适宜水平的MOS能提高草鱼肠道结构完整性和免疫功能。试验三拟通过体外试验,建立草鱼原代IECs和MΦLPS免疫应激模型,进一步验证MOS对肠道细胞免疫功能的影响及可能机制。试验三共设计两个细胞试验:1)LPS诱导条件下,不同水平MOS对原代肠道IECs和MΦ免疫应激的影响;2)MOS对原代肠道IECs和MΦ免疫应激影响可能途径。3.1 LPS诱导条件下,MOS对原代肠道IECs和MΦ免疫应激的影响为研究MOS对草鱼IECs和MΦ增殖的影响,采用CCK-8法测定。共设计6个处理,分别为0(Ctrl)、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/m L MOS组,每组6个重复。结果表明,与对照组相比,IECs和MΦ在MOS添加浓度为0.4、0.6、0.8和1.0 mg/m L时,IECs和MΦ增殖能力显著增强(P<0.05),其中均以0.6 mg/m L MOS组效果最佳,说明0.4-1.0 mg/m L浓度的MOS对IECs和MΦ增殖均有效。为研究MOS对草鱼原代肠道IECs和MΦ免疫功能的影响及可能途径,筛选基于LPS(IECs诱导浓度:20μg/m L,MΦ诱导浓度:40μg/m L)诱导条件下适宜水平的MOS作用浓度,共设计7个处理,分别为0(Ctrl)、0(LPS)、0.2(LPS+MOS)、0.4(LPS+MOS)、0.6(LPS+MOS)、0.8(LPS+MOS)和1.0 mg/m L(LPS+MOS)。结果表明,在LPS免疫应激条件下,0.6-1.0 mg/m L MOS均能显著降低草鱼肠道IECs和MΦ炎症反应,其中TNFα、IL-1β、IL-6和IL-8的m RNA水平显著下调(P<0.05),而IL-10显著上调(P<0.05),均以0.6 mg/m L MOS组效果最佳。3.2 LPS诱导条件下,MOS对原代肠道IECs和MΦ免疫应激影响可能途径为进一步探讨MOS对原代IECs和MΦTLRs信号的影响,细胞试验3.2共设置两个试验。第一个试验共设计4个处理,分别为Ctrl、MOS(0.6 mg/m L)、LPS(20μg/m L或40μg/m L)、LPS+MOS(LPS:20μg/m L或40μg/m L,MOS:0.6 mg/m L),探讨生理条件下和LPS诱导下,MOS对草鱼原代IECs和MΦ免疫反应的影响及可能途径;IECs(LPS:20μg/m L)研究结果表明,与LPS组相比,LPS+MOS组TGF-β1和TGF-β2的m RNA水平显著上调(P<0.05),TNFα、IL-1β、IL-6和IL-8的m RNA水平显著下调(P<0.05),TLR5和NF-κBp65的m RNA水平、My D88、IRAK1、TRAF6和NF-κBp65的蛋白水平均显著下调(P<0.05),说明MOS可能通过抑制TLR5/My D88/NF-κBp65信号途径Navitoclax作用(而不是通过TLR1、TLR2和TLR4)缓解草鱼IECs炎症反应;MΦ(LPS:40μg/m L)研究结果表明,与LPS组相比,LPS+MOS组IL-10、TGF-β1和TGF-β2的m RNA水平显著上调(P<0.05),TNF-αchronic suppurative otitis media、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12p35和IL-12p40的m RNA水平显著下调(P<0.05),TLR2、TLR5和NF-κBp65的m RNA水平、TLR2、My D88、IRAK1、TRAF6和NF-κBp65的蛋白水平显著下调(P<0.05),说明MOS可能通过抑制TLR2/5/NF-κBp65信号途径(而不是通过TLR1和TLR4)缓解草鱼肠道MΦ炎症反应。第二个试验共设计6个处理,分别为Ctrl、LPS(20μg/m L或40μg/m L)、LPS+MOS(LPS:20μg/m L或40μg/m L,MOS:0.6 mg/m L)、LPS+TH1020(LPS:20μg/m L或40μg/m L,TH1020:0.5μM或3μM)、LPS+C29SAG(LPS:20μg/m L或40μg/m L,C29:50μM)、LPS+TH1020+C29(LPS:20μg/m L或40μg/m L,TH1020:0.5μM或3μM,C29:50μM),探讨LPS诱导条件下,对比MOS与TLR2/5抑制剂对草鱼IECs和MΦ中TLRs/NFκB介导炎症反应的抑制效果。IECs(LPS:20μg/m L,TH1020:0.5μM,C29:50μM)研究结果表明,与LPS组相比,LPS+MOS组上调TGF-β2的m RNA水平(P<0.05),下调TNFα、IL-1β、IL-6和IL-8的m RNA水平(P<0.05),下调My D88、IRAK1、TRAF6和NF-κBp65的m RNA水平和蛋白水平(P<0.05),LPS+MOS组TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的m RNA水平显著低于LPS+C29组(P<0.05),IL-1β和IL-6的m RNA水平显著低于LPS+TH1020组(P<0.05),TNF-α、IL-1β、IL-6的m RNA水平和NF-κBp65蛋白水平显著低于LPS+TH1020+C29组(P<0.05),说明0.6 mg/m L MOS能缓解草鱼IECs炎症反应,且效果要优于单独或联合抑制剂的使用效果;MΦ(LPS:40μg/m L,TH1020:3μM,C29:50μM)结果表明:与LPS组相比,LPS+MOS组上调IL-10和TGF-β1的m RNA水平,下调TNFα、IL-1β、IL-6、IL-12p35和IL-12p40的m RNA水平,下调My D88、IRAK4、IRAK1、TRAF6和NF-κBp65的m RNA水平和蛋白水平(P<0.05),且LPS+MOS组的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-12p35的m RNA水平显著高于LPS+TH1020组(P<0.05),IL-1β、IL-6和IL-12p35的m RNA水平显著高于LPS+C29(P<0.05),TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-12p35的m RNA水平和NF-κBp65蛋白水平显著高于LPS+TH1020+C29组(P<0.05),说明0.6 mg/m L MOS能缓解草鱼肠道MΦ炎症反应,且效果要弱于单独或联合抑制剂的使用效果。综上所述,MOS能促进生长中期草鱼肠道生长发育和抗病能力,这与其增强肠道消化吸收能力、结构完整性和免疫功能密切相关。MOS可能通过激活Nrf2信号途径提高肠道抗氧化能力和抑制MLCK和Rho A信号途径,增强肠道顶端连接复合体,维持肠道细胞结构和细胞间结构完整性;还可能通过下调TLR2和TLR5(而不是TLR1和TLR4),抑制NF-κBp65信号途径,调节草鱼肠道免疫屏障功能。以肠炎发病率为标识,体重为200-800 g的草鱼饲粮中MOS的推荐添加量为499.1 mg/kg。