中药柴胡为伞形科植物柴胡(Bupleurum chinense DC)或狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd)的干燥根~([1]),在肝病防治方面具有悠久的应用历史和深厚的中医理论基础支持,具有和解表里,疏肝升阳之功效,主要活性成分为皂苷类成分,其中柴胡皂苷a(SSa)和柴胡皂苷d(SSd)约占80%(1:1)~([2,3])。现代药理学研究表明Compound 3价格柴胡皂苷具有显著的抗肝纤维化作用~([4]),并研究证实SSa和SSd是通过抗炎、抗肝星状细胞(HSCs)活化及抗氧化等多途径拮抗逆转肝纤维化的发生,SSa和SSd互为同分异构体,联合应用可增加药效,产生协同作用~([5-7])。SSa和SSd虽在抗肝纤维化方面有着显著疗效,但其存在溶解性差、生物利用度低、溶血毒性强等诸多问题,严重制约其临床应用研究与开发~([8])。脂质体是一种有着双分子层的小囊泡,类似于生物膜结构,对水溶性和脂溶性药物的包埋率均较高,主要通过膜融合及细胞内吞被细胞摄取,已成为改善药物治疗效果的优良药物载体之一。然而,脂质体中的胆固醇(CHOL)与SSd会发生络合反应,破坏其整体稳定性,限制药物入体释放~([9,10])。同时,普通脂质体递送SSa、SSd易被网状内皮系统(RES)吞噬~([11]),导致药物在肝纤维化病变细胞部位蓄积减少,其靶向性显著降低。此外,研究证实~([12-14])阻断肝纤维化的关键在于抑制HSCs的活化,因此,将具有显著抗肝纤维化作用的SSa、SSd靶向递送至HSCs将有望获得更理想的效果。本文根据HSCs上存在大量视黄醇结合蛋白(RBP)受体表达~([15,16]),且RBP可与维生素A(VA)进行特异性结合的特点,构建具有HSCs靶向性的VA-SSa/SSd-Lips。该递药体系可显著降低药物毒性,提升药物在病灶部位的蓄积浓度,改善药物生物利用度,为实现肝纤维化的靶向治疗奠定基础。本文第一部分以DSPE-PEG-NH_2、维甲酸(RA)为原料,EDC·HCl和NHS为催化剂激活维甲酸的羧基,调整各原料药投药量比例,通过酰胺反应将VA结构搭载于具有良好生物相容性的磷脂衍生物DSPE-PEG-NH_2合成靶向配体DSPE-PEG-VA。利用氢核磁共振(~1H-NMR)对产物进行结构鉴定与分析,采用MALDI-TOF-MS对DSPE-PEG-VA的分子量进行验证,结果表明靶向材料连接成功。利用薄膜分散超声法成功制备了基于视黄醇蛋白受体(RBPR)VA靶向肝星状细胞脂质体递药体系VA-SSa/SSd-Lips(CHEM)。并用CCK_8法研究不同DSPE-PEG-VA百分比密度下的VA-SSa/SSd-Lips(CHEM)对HSC-T6细胞抑制率的作用,筛选出最佳靶向配体浓度为1%。本文第二部分考察制剂VA-SSa/SSd-Lips的理化性质(粒径电位、包封率(EE%)和稳定性)。制备方法采用薄膜分散超声法,药物在磷脂双分子层的亲脂基作用下被动蓄积在脂质的磷脂双分子层之间。设定药脂比0.1,首先筛选考察三种EE%测定方法,根据药物理化性质结果选取鱼精蛋白沉淀法测定EE%。测得DLE分别为97.56%(SSa)和98.92%(SSd);载药量(DLC)分别为4.57%(SSa)和4.64%(SSd)。采用动态透析法考察SSa/SSd-Sol、SSa/SSd-Lips和VA-SSa/SSd-Lips的体外释放行为,结果表明普通SSa/SSd-Sol在24 h内释达放89.53%(SSa)、89.89%(SSd),释药基本完全;SSa/SSd-Lips和VA-SSa/SSd-Lips在24 h内释药量相对较少,期间VA-SSa/SSd-Lips释放相对缓慢。因此,与SSa/SSd-Sol相比SSa/SSd-Lips和VA-SSa/SSd-Lips有了递药体系的包载后,其释药速率相对放缓。采用动态光散射(DLS)和TEM考察了VA-SSa/SSd-Lips制剂的外观、粒径、Zeta电位及形态,VA-SSa/SSd-Lips表现为澄清透明带有白色乳光液态物质,140 nm左右的粒径,有较窄的粒径分布,带负电,TEM观测形态表现为类球形。本文第三部分建立高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)分析方法,测定了大鼠血浆中SSa/SSd浓度,研究SSa/SSd溶液、SSa/SSd-Lips及VA-SSa/SSd-Lips在大鼠体内的药动学行为,同时通过动物活体成像及体外细胞摄取考察SSa/SSd的三种制剂的靶向性。药动实验结果表明,SSa/SSd及内标(三七皂苷R_1)均能得到较好分离,并未干扰SSa/SSd的测定,且有测定时间短,灵敏度较高以及重现性好的优点,可以用于测定SSa/SSd溶液、SSa/SSd-Lips及VA-SSa/SSd-Lips给药后在大鼠体内血浆药物浓度,评价药物入体后分布以及药物代谢过程。大鼠尾静脉注射SSa/SSd溶液、SSa/SSd-Lips及VA-SSa/SSd-Lips后结果显示,游离组SSa/SSd-Sol中的SSa、SSd在小鼠体内消除较快,SSa/SSd-Sol组的SSa、SSd的t_(1/2)分别为0.958、0.759 h,SSa/SSd-Lips的t_(1/2)分别是SSa/SSd-Sol组的1.17(SSa)和1.25(SSd)倍,而VA-SSa/SSd-Lips的t_(1/2)分别是SSa/SSd-Sol组的2.46(SSa)和3.19(SSd)倍;且给予VA-SSa/SSd-Lips后,t_(1/2)显著高于SSa/SSd溶液,说明VA-SSa/SSd-Lips具有一定的缓释作用。体内活体成像考察VA-Di R-Lips制剂荧光主要集中在肝脏区域,且其他脏器分布较少,与Di R-Lips相较,VA-Di R-Lips具有显著的肝脏趋向性。选择大鼠肝星状细胞,通过荧光CCRG 81045供应商显微镜观察活化的肝星状细胞对Di R-Sol、Di R-Lips和VA-Di R-Lips的摄取情况,结果表明VA-Di R-Lips组的荧光强度明显强于Di R-Lips组,且游离SSa/SSd组荧光强度最弱。采用激光共聚焦进行荧光共定位实验,结果表明靶向组制剂VA-C6-Lips组相较于非靶向组C6-Lips靶向活化肝星状细胞效率更高,且同时结果表明新型膜稳定CHEM与普通膜稳定剂CHOL在HSCs靶向方面影响不大,最后通过流式细胞仪定量分析VA-C6-Lips(CHEM)、C6-Lips以及VA-C6-Lips(CHOL)对HSCs的靶向效率。综合结果说明VA-C6-Lips(CHEM)具有良好的HSCs靶向作用。本研究第四部分建立肝纤维化小鼠模型,从血清生化指标(AST/ALT)、肝脏病理检查(H&E染色/Masson染色)、肝脏免疫组化(α-SMA/COIⅠ)等指标评价高中低浓度VA-SSa/SSd-Lips制剂组对肝纤维化的治疗效果,探讨VA-SSa/SSd-Lips的抗肝纤维化机制。从ALT和AST实验结果中发现,与生理盐水组比较,造模组(未经药物干预治疗)小鼠血清中AST及ALT显著升高(P<0.05),表明造模组炎症因子水平较高;而经高中低浓度VA-SSa/SSd-Lips制剂以及阳性药物组(水飞蓟宾)治疗后,各组大鼠血清中AST及ALT含量有不同程度下降,与造模组比较,阳性药物组ALT显著性降低;与造模组相比,高中低浓度VA-SSa/SSd-Lips制剂组的AST及ALT含量均有所降低,且差异显著(P<0.01)。其次观测各组小鼠的肝组织染色发现,生理盐水Immune infiltrate组(未造模组)中H&E染色后的组织切片中肝小叶结构完整,各肝结构排列规则,未形成纤维间隔,且无组织细胞损伤现象;在Masson染色中则可观测少量的绿色呈链状态的胶原纤维;而造模组肝组织的H&E染色表现出中性粒细胞浸润渗透明显,且大面积组织细胞受损死亡;Masson染色镜检则表现为大量胶原纤维增生胶原纤维带形成,假小叶形成。经由高中低VA-SSa/SSd-Lips制剂组治疗后,胶原增生情况得到明显改善。通过使用Image J进行半定量分析发现,造模组胶原显色区域显著高于其他各组(P<0.05)。经治疗后各组胶原显色区域有不同程度降低,本实验中阳性药物组胶原显色区域较之高中低三种浓度VA-SSa/SSd-Lips制剂的降低程度要小,可发现胶原显色区域最小的为低剂量组,但三种剂量组的胶原显色区域差别不大。在免疫组化研究中,小鼠肝脏组织α-SMA以及COIⅠ免疫组化染色棕黄色,为阳性表达。正常组(生理盐水组)可观测到有轻微阳性表达;而造模组α-SMA和COIⅠ阳性表达明显增加。根据免疫组化染色片子进行棕黄色表达半定量分析,与正常组比较,造模组表达显著增加(P<0.05);经治疗后的各制剂组表达都有不同程度降低。与造模组比较,阳性药物组(P<0.05)和低中高浓度组(P<0.05)棕黄色区域相对减少。细胞抑制实验(CCK_8)考察空白脂质体材料以及新型膜稳定剂的细胞毒性及载药脂质体的体外抗肝纤维化活性,由DSPE-PEG-VA修饰的空白脂质体细胞毒性较低;VA-SSa/SSd-Lips(CHEM)(IC50=31)较于SSa/SSd-Lips(IC50=53)以及游离SSa/SSd溶液(IC50=43)的细胞毒性更高,而普通膜稳定构建的靶向脂质体制剂VA-SSa/SSd-Lips(CHOL)(IC50=41)与游离SSa/SSd溶液的细胞毒性相差不大。综合结果说明VA-SSa/SSd-Lips(CHEM)具有良好的HSCs抑制作用,且体外溶血考察及体内安全性评价实验均表明VA-SSa/SSd-Lips具有良好的安全性。