由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的植物灰霉病可造成多种农作物的严重减产,是农业生产上的重要病害之一,在果蔬及花卉的生产和储运过程中危害严重。灰葡萄孢的寄主范围十分广泛,是一种世界性分布的死体营养型植物病害真菌。灰葡萄孢能侵染1000多种植物,包括农业生产上的重要经济作物,如蔬菜、水果以及各种花卉等。研究灰葡萄孢致病相关基因的功能可进一步阐明灰葡萄孢的致病机理,并为开发灰霉病的防控新策略提供理论依据。在前期的研究工作中,结合灰葡萄孢侵染阶段的分泌蛋白组和RNA-Seq数据,筛选出一个小分子分泌蛋白BcSSP2。在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片中瞬时表达该蛋白后,初期可引起植物叶片的黄化褪绿,后期会进一步导致叶片坏死。本研究首先对BcSSP2进行了生物信息学分析并对BcSSP2蛋白进行了蛋白定位分析;为了进一步研究BcSSP2基因在灰葡萄孢侵染过程中的功能,对BcSSP2基因进行了敲除和超表达,并对敲除转化子和超表达转化子的生长速度、菌落形态、产孢量、抗逆性以及致病力等表型进行了分析;另外,还对BcSSP2蛋白的热获悉更多稳定性、对不同植物的毒性、植物抗性的诱导以及BAK1和SOBIR1对BcSSP2的信号调控等特性进行了深入研究,实验结果如下:(1)生物信息学分析表明,BcSSP2是灰葡萄孢中的一个单拷贝基因,编码90个氨基酸,含有10个半胱氨酸残基,其中8个残基高度保守。BcSSP2蛋白N端的前20个氨基酸预测为信号肽序列。3D结构显示,BcSSP2的蛋白质结C59构包含两个外侧的α-螺旋结构和两个内部β-折叠结构。具有高度相似性的BcSSP2同源蛋白仅存在于少数真菌属中,其中大部分是植物病原菌。在活体营养型植物病原菌和人类病原菌中没有发现其同源蛋白,表明该蛋白在促进植物坏死过程中可能起到某种特殊的作用;(2)BcSSP2的蛋白定位分析证实了BcSSP2信号肽的分泌功能,验证了BcSSP2为分泌蛋白,其对植物的毒性依赖于其在叶片细胞质外体空间的定位。BcSSP2蛋白的亚细胞定位结果表明,BcSSP2蛋白分布在植物细胞质膜和植物细胞膜周围的颗粒状或假定的囊泡状结构附近,BcSSP2蛋白除了在质外体中具有植物毒性的活性外,还可能在侵染初期分泌到外质体空间后再次进入植物细胞;(3)BcSSP2的基因功能研究结果表明,BcSSP2基因的表达在感染晚期上调,BcSSP2基因的敲除转化子和超表达转化子的菌落形态、菌核和孢子形成、菌丝生长率、菌株的分生孢子产量、抗逆性和致病力与野生型灰葡萄孢相比并无明Biocomputational method显差别,BcSSP2基因的敲除或超表达不会显著影响灰葡萄孢侵染的最终结果。这表明真菌中含有多余功能或大量的功能相似效应蛋白的存在,单独敲除或超表达某个效应蛋白不会显著影响病原菌的最终致病效果;(4)BcSSP2蛋白诱导植物坏死的研究结果显示,BcSSP2蛋白对多种双子叶植物具有毒性,但对单子叶植物没有毒性。BcSSP2蛋白具有热稳定性,将BcSSP2蛋白在100℃下加热30min可以降低其对植物的毒性,但不能完全消除其毒性。此外,BcSSP2蛋白某些表位受到特定的半胱氨酸残基的影响,能够介导BcSSP2蛋白对植物的毒性;(5)BcSSP2蛋白对植物抗性影响的相关实验表明,BcSSP2除了具有植物毒性外,还可以引发植物抗性,且BcSSP2引起的烟草抗性增强与烟草抗性相关基因表达的变化有关,但BcSSP2并不能诱导植物的系统性抗性;(6)利用病毒诱导的基因沉默实验显示,BAK1和SOBIR1负调控BcSSP2对本氏烟草的植物毒性。BcSSP2在BAK1或SOBIR1的沉默植株中所引发的植物坏死比其在野生植株中所引起的更为严重。结果表明,BcSSP2对植物毒性的信号是通过一个未知的信号转导途径介导的,并受到BAK1和SOBIR1的负调控。